La enfermedad de Alzheimer (EA) carece de biomarcadores proteicos que reflejen su múltiple fisiopatología subyacente, lo que dificulta el progreso del diagnóstico y el tratamiento. Aquí, utilizamos proteómica integral para identificar biomarcadores del líquido cefalorraquídeo (LCR) que representan una amplia gama de fisiopatología de la EA. La espectrometría de masas múltiplex identificó aproximadamente 3500 y aproximadamente 12 000 proteínas en el LCR de la EA y el cerebro, respectivamente. El análisis de la red del proteoma cerebral resolvió 44 módulos de biodiversidad, 15 de los cuales se superponían con el proteoma del líquido cefalorraquídeo. Los marcadores de AD del LCR en estos módulos superpuestos están plegados en cinco grupos de proteínas, que representan diferentes procesos fisiopatológicos. Las sinapsis y los metabolitos en el cerebro con EA disminuyen, pero el LCR aumenta, mientras que la mielinización rica en glial y los grupos inmunes en el cerebro y el LCR aumentan. La consistencia y la especificidad de la enfermedad de los cambios del panel se confirmaron en más de 500 muestras adicionales de LCR. Estos grupos también identificaron subgrupos biológicos en la EA asintomática. En general, estos resultados son un paso prometedor hacia herramientas de biomarcadores basadas en la web para aplicaciones clínicas en la EA.
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa más común de demencia neurodegenerativa en todo el mundo y se caracteriza por una amplia gama de disfunciones del sistema biológico, incluida la transmisión sináptica, la inmunidad mediada por la glía y el metabolismo mitocondrial (1-3). Sin embargo, sus biomarcadores proteicos establecidos todavía se centran en detectar la proteína amiloide y tau y, por lo tanto, no pueden reflejar esta fisiopatología diversa. Estos biomarcadores proteicos “centrales” que se miden de manera más confiable en el líquido cefalorraquídeo (LCR) incluyen (i) el péptido beta amiloide 1-42 (Aβ1-42), que refleja la formación de placas amiloides corticales; (ii) tau total, un signo de degeneración del axón; (iii) fosfo-tau (p-tau), un representante de la hiperfosforilación patológica de tau (4-7). Aunque estos biomarcadores del líquido cefalorraquídeo han facilitado enormemente nuestra detección de enfermedades con proteínas de EA "marcadas" (4-7), sólo representan una pequeña parte de la compleja biología detrás de la enfermedad.
La falta de diversidad fisiopatológica de los biomarcadores de la EA ha generado muchos desafíos, incluyendo (i) la incapacidad de identificar y cuantificar la heterogeneidad biológica de los pacientes con EA, (ii) una medición insuficiente de la gravedad y la progresión de la enfermedad, especialmente en la etapa preclínica, y ( iii) el desarrollo de fármacos terapéuticos que no lograron resolver por completo todos los aspectos del deterioro neurológico. Nuestra dependencia de patologías históricas para describir la EA de enfermedades relacionadas solo exacerba estos problemas. Cada vez hay más evidencias que muestran que la mayoría de las personas mayores con demencia tienen más de una característica patológica de deterioro cognitivo (8). Hasta el 90% o más de las personas con patología de EA también tienen enfermedad vascular, inclusiones de TDP-43 u otras enfermedades degenerativas (9). Estas altas proporciones de superposición patológica han alterado nuestro marco diagnóstico actual para la demencia, y se necesita una definición fisiopatológica más completa de la enfermedad.
En vista de la necesidad urgente de una variedad de biomarcadores de la EA, el campo está adoptando cada vez más el método "ómico" basado en el sistema general para descubrir biomarcadores. La Alianza Farmacéutica Acelerada (AMP)-AD se lanzó en 2014 y está a la vanguardia del programa. Este esfuerzo multidisciplinario de los Institutos Nacionales de Salud, la academia y la industria tiene como objetivo utilizar estrategias basadas en sistemas para definir mejor la fisiopatología de la EA y desarrollar estrategias de tratamiento y análisis de diagnóstico de la biodiversidad (10). Como parte de este proyecto, la proteómica de redes se ha convertido en una herramienta prometedora para el avance de biomarcadores sistémicos en la EA. Este enfoque imparcial basado en datos organiza conjuntos de datos proteómicos complejos en grupos o "módulos" de proteínas coexpresadas que están asociadas con tipos de células, orgánulos y funciones biológicas específicas (11-13). Se han realizado casi 12 estudios proteómicos de redes ricos en información en el cerebro con EA (13-23). En general, estos análisis indican que el proteoma de la red cerebral de la EA mantiene una organización modular altamente conservada en cohortes independientes y múltiples regiones corticales. Además, algunos de estos módulos muestran cambios reproducibles en la abundancia relacionada con la EA en todos los conjuntos de datos, lo que refleja la fisiopatología de múltiples enfermedades. En conjunto, estos hallazgos demuestran un punto de anclaje prometedor para el descubrimiento del proteoma de la red cerebral como biomarcador sistémico en la EA.
Para transformar el proteoma de la red cerebral de la EA en biomarcadores basados en sistemas clínicamente útiles, combinamos la red derivada del cerebro con el análisis proteómico del LCR de la EA. Este enfoque integrado condujo a la identificación de cinco conjuntos prometedores de biomarcadores del LCR que están asociados con una amplia gama de fisiopatología cerebral, incluidas sinapsis, vasos sanguíneos, mielinización, inflamación y disfunción de las vías metabólicas. Validamos con éxito estos paneles de biomarcadores mediante múltiples análisis de replicación, incluidas más de 500 muestras de LCR de diversas enfermedades neurodegenerativas. Estos análisis de validación incluyen examinar objetivos grupales en el LCR de pacientes con EA asintomática (AsymAD) o mostrar evidencia de acumulación anormal de amiloide en un entorno cognitivo normal. Estos análisis resaltan la significativa heterogeneidad biológica en la población AsymAD e identifican marcadores de panel que pueden subtipos de individuos en las primeras etapas de la enfermedad. En general, estos resultados representan un paso clave en el desarrollo de herramientas de biomarcadores de proteínas basadas en múltiples sistemas que pueden resolver con éxito muchos de los desafíos clínicos que enfrenta la EA.
El objetivo principal de este estudio es identificar nuevos biomarcadores del líquido cefalorraquídeo que reflejen diversas fisiopatologías cerebrales que conducen a la EA. La Figura S1 describe nuestra metodología de investigación, que incluye (i) un análisis integral impulsado por hallazgos preliminares de AD CSF y el proteoma cerebral en red para identificar múltiples biomarcadores de enfermedades del LCR relacionados con el cerebro, y (ii) la replicación posterior. Estos biomarcadores se encuentran en varios biomarcadores cerebroespinales independientes. cohortes fluidas. La investigación orientada al descubrimiento comenzó con el análisis de la expresión diferencial del LCR en 20 individuos cognitivamente normales y 20 pacientes con EA en el Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer Emory Goizueta (ADRC). El diagnóstico de EA se define como un deterioro cognitivo significativo en presencia de niveles bajos de Aβ1-42 y niveles elevados de tau total y p-tau en el líquido cefalorraquídeo [Evaluación cognitiva media de Montreal (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA )]] (Tabla S1A). El control (MoCA medio, 26,7 ± 2,2) tenía niveles normales de biomarcadores del LCR.
El LCR humano se caracteriza por un rango dinámico de abundancia de proteínas, en el que la albúmina y otras proteínas extremadamente abundantes pueden impedir la detección de proteínas de interés (24). Para aumentar la profundidad del descubrimiento de proteínas, eliminamos las primeras 14 proteínas altamente abundantes de cada muestra de LCR antes del análisis por espectrometría de masas (MS) (24). La EM identificó un total de 39.805 péptidos, que se asignaron a 3.691 proteomas en 40 muestras. La cuantificación de proteínas se realiza mediante etiquetado de múltiples etiquetas de masa en tándem (TMT) (18, 25). Para resolver los datos faltantes, incluimos solo aquellas proteínas que se cuantificaron en al menos el 50% de las muestras en el análisis posterior, cuantificando así finalmente 2875 proteomas. Debido a la diferencia significativa en los niveles de abundancia de proteína total, una muestra de control se consideró estadísticamente un valor atípico (13) y no se incluyó en el análisis posterior. Los valores de abundancia de las 39 muestras restantes se ajustaron según la edad, el sexo y la covarianza del lote (13-15, 17, 18, 20, 26).
Utilizando el análisis estadístico de la prueba t para evaluar la expresión diferencial en el conjunto de datos de regresión, este análisis identificó proteínas cuyos niveles de abundancia cambiaron significativamente (P <0,05) entre los casos de control y AD (Tabla S2A). Como se muestra en la Figura 1A, la abundancia de un total de 225 proteínas en la EA se redujo significativamente y la abundancia de 303 proteínas aumentó significativamente. Estas proteínas expresadas diferencialmente incluyen varios marcadores de EA del líquido cefalorraquídeo previamente identificados, como la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT; P = 3,52 × 10−8), el neurofilamento (NEFL; P = 6,56 × 10−3), la proteína 43 relacionada con el crecimiento. (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Proteína de unión a ácidos grasos 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Quitinasa 3 como 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Granulina neuronal (NRGN; P = 3,43 × 10−4) y factor de crecimiento nervioso VGF (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Sin embargo, también identificamos otros objetivos muy importantes, como el inhibidor de disociación GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) y la unión modular de calcio relacionada con SPARC 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). El análisis de ontología genética (GO) de 225 proteínas significativamente reducidas reveló conexiones estrechas con procesos de fluidos corporales como el metabolismo de los esteroides, la coagulación sanguínea y la actividad hormonal (Figura 1B y Tabla S2B). Por el contrario, el aumento significativo de proteína de 303 está estrechamente relacionado con la estructura celular y el metabolismo energético.
(A) El gráfico del volcán muestra el cambio de log2 (eje x) en relación con el valor P estadístico -log10 (eje y) obtenido por la prueba t, que se utiliza para detectar la expresión diferencial entre el control (CT) y Casos de EA del proteoma del LCR de todas las proteínas. Las proteínas con niveles significativamente reducidos (P <0,05) en la EA se muestran en azul, mientras que las proteínas con niveles significativamente aumentados en la enfermedad se muestran en rojo. La proteína seleccionada está etiquetada. (B) Los principales términos GO relacionados con las proteínas se reducen significativamente (azul) y aumentan (rojo) en la EA. Muestra los tres términos GO con las puntuaciones z más altas en los campos de procesos biológicos, funciones moleculares y componentes celulares. (C) MS midió el nivel de MAPT en una muestra de LCR (izquierda) y su correlación con el nivel de tau ELISA de la muestra (derecha). Se muestra el coeficiente de correlación de Pearson con el valor P relevante. Debido a la falta de datos de ELISA para un caso de EA, estas cifras incluyen valores de 38 de los 39 casos analizados. (D) El análisis de conglomerados supervisado (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) ajustó P <0,01) en el control y AD CSF encontró muestras utilizando las 65 proteínas con cambios más significativos en el conjunto de datos. Estandarizar, normalizar.
El nivel proteómico de MAPT está estrechamente relacionado con el nivel de ELISA tau medido de forma independiente (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Figura 1C), lo que respalda la validez de nuestra medición de EM. Después de la digestión con tripsina al nivel de la proteína precursora de amiloide (APP), los péptidos específicos de isoforma mapeados en el extremo C de Aβ1-40 y Aβ1-42 no pueden ionizarse de manera eficiente (27, 28). Por tanto, los péptidos APP que identificamos no tienen nada que ver con los niveles de ELISA Aβ1-42. Para evaluar la expresión diferencial de cada caso, utilizamos proteínas expresadas diferencialmente con P <0,0001 [tasa de descubrimiento falso (FDR) corregida P <0,01] para realizar un análisis de conglomerados supervisado de las muestras (Tabla S2A). Como se muestra en la Figura 1D, estas 65 proteínas altamente significativas pueden agrupar correctamente las muestras según el estado de la enfermedad, excepto en un caso de EA con características similares a las del control. De estas 65 proteínas, 63 aumentaron en la EA, mientras que sólo dos (CD74 e ISLR) disminuyeron. En total, estos análisis del líquido cefalorraquídeo han identificado cientos de proteínas en la EA que pueden servir como biomarcadores de la enfermedad.
Luego realizamos un análisis de red independiente del proteoma cerebral de la EA. La cohorte cerebral de este descubrimiento incluyó casos de corteza prefrontal dorsolateral (DLPFC) de control (n = 10), enfermedad de Parkinson (EP; n = 10), EA/EP mixta (n = 10) y EA (n = 10). ) Muestra. Emery Goizueta ADRC. Los datos demográficos de estos 40 casos se describieron previamente (25) y se resumen en la Tabla S1B. Utilizamos TMT-MS para analizar estos 40 tejidos cerebrales y la cohorte de replicación de 27 casos. En total, estos dos conjuntos de datos cerebrales produjeron 227.121 péptidos únicos, que se asignaron a 12.943 proteomas (25). En investigaciones posteriores solo se incluyeron aquellas proteínas que se cuantificaron en al menos el 50% de los casos. El conjunto de datos del descubrimiento final contiene 8817 proteínas cuantificadas. Ajuste los niveles de abundancia de proteínas según la edad, el sexo y el intervalo post-mortem (PMI). El análisis de expresión diferencial del conjunto de datos después de la regresión mostró que >2000 niveles de proteína cambiaron significativamente [P <0,05, análisis de varianza (ANOVA)] en dos o más cohortes de enfermedades. Luego, realizamos un análisis de conglomerados supervisado basado en las proteínas expresadas diferencialmente y P <0,0001 en comparaciones AD/control y/o AD/PD (Figura S2, A y B, Tabla S2C). Estas 165 proteínas altamente alteradas representan claramente casos con patología de EA a partir de las muestras de control y de EP, lo que confirma los fuertes cambios específicos de la EA en todo el proteoma.
Luego utilizamos un algoritmo llamado Análisis de red de coexpresión de genes ponderados (WGCNA) para realizar un análisis de red en el proteoma cerebral descubierto, que organiza el conjunto de datos en módulos de proteínas con patrones de expresión similares (11-13). El análisis identificó 44 módulos (M) de proteínas coexpresadas, ordenadas y numeradas desde las más grandes (M1, n = 1821 proteínas) hasta las más pequeñas (M44, n = 34 proteínas) (Figura 2A y Tabla S2D). Como se mencionó anteriormente (13) Calcule el perfil de expresión representativo o proteína característica de cada módulo y correlacionelo con el estado de la enfermedad y la patología de la EA, es decir, establezca la alianza del Registro de la enfermedad de Alzheimer (CERAD) y la puntuación de Braak (Figura 2B). En general, 17 módulos se relacionaron significativamente con la neuropatología de la EA (P <0,05). Muchos de estos módulos relacionados con enfermedades también son ricos en marcadores específicos del tipo de célula (Figura 2B). Como se mencionó anteriormente (13), el enriquecimiento del tipo de célula se determina analizando la superposición del módulo y la lista de referencia de genes específicos del tipo de célula. Estos genes se derivan de datos publicados en neuronas aisladas de ratón, células endoteliales y gliales. Experimento de secuenciación de ARN (RNA-seq) (29).
(A) Descubra el WGCNA del proteoma cerebral. (B) Análisis de correlación media de bipeso (BiCor) de la proteína de firma modular (el primer componente principal de la expresión de la proteína modular) con características neuropatológicas de la EA (arriba), incluidas las puntuaciones CERAD (placa Aβ) y Braak (ovillos de tau). Las intensidades de las correlaciones positivas (rojas) y negativas (azul) se muestran mediante un mapa de calor de dos colores, y los asteriscos indican significación estadística (P <0,05). Utilice la prueba exacta de Fisher hipergeométrica (FET) (abajo) para evaluar la asociación del tipo de célula de cada módulo de proteína. La intensidad del sombreado rojo indica el grado de enriquecimiento del tipo celular y el asterisco indica significación estadística (P <0,05). Utilice el método BH para corregir el valor P derivado del FET. (C) Análisis GO de proteínas modulares. Los procesos biológicos más estrechamente relacionados se muestran para cada módulo o grupo de módulos relacionados. oligo, oligodendrocito.
Un conjunto de cinco módulos ricos en astrocitos y microglía estrechamente relacionados (M30, M29, M18, M24 y M5) mostraron una fuerte correlación positiva con la neuropatología de la EA (Figura 2B). El análisis de ontología vincula estos módulos gliales con el crecimiento, la proliferación y la inmunidad celular (Figura 2C y Tabla S2E). Dos módulos gliales adicionales, M8 y M22, también están fuertemente regulados al alza en la enfermedad. M8 está altamente relacionado con la vía del receptor tipo Toll, una cascada de señalización que desempeña un papel clave en la respuesta inmune innata (30). Al mismo tiempo, M22 está estrechamente relacionado con la modificación postraduccional. M2, que es rico en oligodendrocitos, muestra una fuerte correlación positiva con la patología de la EA y una conexión ontológica con la síntesis de nucleósidos y la replicación del ADN, lo que indica una mayor proliferación celular en las enfermedades. En general, estos hallazgos respaldan la elevación de los módulos gliales que hemos observado previamente en el proteoma de la red AD (13, 17). Actualmente se ha descubierto que muchos módulos gliales relacionados con la EA en la red muestran niveles de expresión más bajos en los casos de control y de EP, lo que destaca su especificidad de enfermedad que es elevada en la EA (Figura S2C).
Solo cuatro módulos en nuestro proteoma de red (M1, M3, M10 y M32) están fuertemente correlacionados negativamente con la patología de la EA (P <0,05) (Figura 2, B y C). Tanto M1 como M3 son ricos en marcadores neuronales. M1 está altamente relacionado con las señales sinápticas, mientras que M3 está estrechamente relacionado con la función mitocondrial. No hay evidencia de enriquecimiento del tipo celular para M10 y M32. M32 refleja la conexión entre M3 y el metabolismo celular, mientras que M10 está altamente relacionado con el crecimiento celular y la función de los microtúbulos. En comparación con la EA, los cuatro módulos aumentan en control y EP, lo que les proporciona cambios de EA específicos de la enfermedad (Figura S2C). En general, estos resultados respaldan la disminución de la abundancia de módulos ricos en neuronas que hemos observado previamente en la EA (13, 17). En resumen, el análisis de la red del proteoma cerebral que descubrimos produjo módulos alterados específicamente para la EA de acuerdo con nuestros hallazgos anteriores.
La EA se caracteriza por una etapa asintomática temprana (AsymAD), en la que los individuos presentan acumulación de amiloide sin deterioro cognitivo clínico (5, 31). Esta etapa asintomática representa una ventana crítica para la detección e intervención tempranas. Anteriormente hemos demostrado una fuerte preservación modular del proteoma de la red cerebral AsymAD y AD en conjuntos de datos independientes (13, 17). Para garantizar que la red cerebral que descubrimos actualmente sea consistente con estos hallazgos anteriores, analizamos la preservación de 44 módulos en el conjunto de datos replicados de 27 organizaciones DLPFC. Estas organizaciones incluyen casos de control (n = 10), AsymAD (n = 8) y AD (n = 9). Se incluyeron muestras de control y de EA en el análisis de nuestra cohorte de descubrimiento de cerebros (Tabla S1B), mientras que los casos de AsymAD fueron únicos solo en la cohorte de replicación. Estos casos de AsymAD también provienen del banco de cerebros ADRC de Emory Goizueta. Aunque la cognición era normal en el momento de la muerte, los niveles de amiloide eran anormalmente altos (CERAD medio, 2,8 ± 0,5) (Tabla S1B).
El análisis TMT-MS de estos 27 tejidos cerebrales dio como resultado la cuantificación de 11.244 proteomas. Este recuento final incluye únicamente aquellas proteínas cuantificadas en al menos el 50% de las muestras. Este conjunto de datos replicados contiene 8638 (98,0%) de las 8817 proteínas detectadas en nuestro análisis cerebral de descubrimiento, y tiene casi 3000 proteínas con cambios significativos entre las cohortes de control y AD (P <0,05, después de la prueba t pareada de Tukey para el análisis de varianza) ( Tabla S2F). Entre estas proteínas expresadas diferencialmente, 910 también mostraron cambios de nivel significativos entre los casos de EA y de control del proteoma cerebral (P <0,05, después de la prueba t pareada de ANOVA Tukey). Vale la pena señalar que estos 910 marcadores son muy consistentes en la dirección del cambio entre proteomas (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Figura S3A). Entre las proteínas aumentadas, las proteínas con los cambios más consistentes entre los conjuntos de datos son principalmente miembros de los módulos M5 y M18 ricos en glial (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 y GFAP). Entre las proteínas reducidas, aquellas con los cambios más consistentes fueron casi exclusivamente miembros del módulo M1 (NPTX2, VGF y RPH3A) asociado con la sinapsis. Además, verificamos los cambios relacionados con la EA de midkine (MDK), CD44, proteína 1 relacionada con el frizzled secretada (SFRP1) y VGF mediante transferencia Western (Figura S3B). El análisis de preservación del módulo mostró que alrededor del 80% de los módulos de proteínas (34/44) en el proteoma cerebral se conservaron significativamente en el conjunto de datos de replicación (puntuación z> 1,96, P corregido por FDR <0,05) (Figura S3C). Catorce de estos módulos se reservaron especialmente entre los dos proteomas (puntuación z> 10, P corregido por FDR <1,0 × 10-23). En general, el descubrimiento y la replicación del alto grado de consistencia en la expresión diferencial y la composición modular entre el proteoma cerebral resalta la reproducibilidad de los cambios en las proteínas de la corteza frontal de la EA. Además, también confirmó que AsymAD y enfermedades más avanzadas tienen una estructura de red cerebral muy similar.
Un análisis más detallado de la expresión diferencial en el conjunto de datos de replicación cerebral resalta el grado significativo de cambios en la proteína AsymAD, incluido un total de 151 proteínas con cambios significativos entre AsymAD y el control (P <0,05) (Figura S3D). De acuerdo con la carga de amiloide, la APP en el cerebro de AsymAD y AD aumentó significativamente. MAPT solo cambia significativamente en la EA, lo que es consistente con mayores niveles de ovillos y su conocida correlación con el deterioro cognitivo (5, 7). Los módulos ricos en glial (M5 y M18) se reflejan en gran medida en el aumento de proteínas en AsymAD, mientras que el módulo M1 relacionado con las neuronas es el más representativo de las proteínas disminuidas en AsymAD. Muchos de estos marcadores AsymAD muestran mayores cambios en enfermedades sintomáticas. Entre estos marcadores se encuentra SMOC1, una proteína glial perteneciente a M18, que se asocia con tumores cerebrales y el desarrollo de ojos y extremidades (32). MDK es un factor de crecimiento de unión a heparina relacionado con el crecimiento celular y la angiogénesis (33), otro miembro de M18. En comparación con el grupo de control, AsymAD aumentó significativamente, seguido de un mayor aumento en AD. Por el contrario, la proteína sináptica neuropentraxina 2 (NPTX2) se redujo significativamente en el cerebro AsymAD. NPTX2 se asoció previamente con la neurodegeneración y tiene un papel reconocido en la mediación de las sinapsis excitadoras (34). En general, estos resultados revelan una variedad de cambios proteicos preclínicos diferentes en la EA que parecen progresar con la gravedad de la enfermedad.
Dado que hemos alcanzado una profundidad significativa de cobertura de proteínas en el descubrimiento del proteoma cerebral, estamos tratando de comprender más completamente su superposición con el transcriptoma AD a nivel de red. Por lo tanto, comparamos el proteoma cerebral que descubrimos con el módulo que generamos previamente a partir de la medición de microarrays de 18.204 genes en tejidos DLPFC con EA (n = 308) y control (n = 157) (13). superposición. En total, identificamos 20 módulos de ARN diferentes, muchos de los cuales demostraron el enriquecimiento de tipos de células específicos, incluidas neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglía (Figura 3A). Los múltiples cambios de estos módulos en AD se muestran en la Figura 3B. De acuerdo con nuestro análisis anterior de superposición de proteína-ARN utilizando el proteoma de EM más profundo sin marcar (alrededor de 3000 proteínas) (13), la mayoría de los 44 módulos en la red del proteoma cerebral que encontramos están en la red del transcriptoma. No hay una superposición significativa. En nuestro descubrimiento y replicación de los 34 módulos proteicos que están altamente retenidos en el proteoma cerebral, solo 14 (~40%) pasaron la prueba exacta de Fisher (FET) y demostraron tener una superposición estadísticamente significativa con el transcriptoma (Figura 3A). Compatible con reparación de daños en el ADN (P-M25 y P-M19), traducción de proteínas (P-M7 y P-M20), unión/empalme de ARN (P-M16 y P-M21) y direccionamiento de proteínas (P-M13 y P- M23) no se superpone con los módulos del transcriptoma. Por lo tanto, aunque en el análisis de superposición actual se utiliza un conjunto de datos de proteoma más profundo (13), la mayor parte del proteoma de la red AD no está asignado a la red transcriptoma.
(A) La FET hipergeométrica demuestra el enriquecimiento de marcadores específicos del tipo de célula en el módulo de ARN del transcriptoma de AD (arriba) y el grado de superposición entre los módulos de ARN (eje x) y proteína (eje y) del cerebro de AD (abajo) . La intensidad del sombreado rojo indica el grado de enriquecimiento de los tipos de células en el panel superior y la intensidad de la superposición de los módulos en el panel inferior. Los asteriscos indican significación estadística (P <0,05). (B) El grado de correlación entre los genes característicos de cada módulo del transcriptoma y el estado de AD. Los módulos de la izquierda tienen la correlación más negativa con AD (azul), y los de la derecha tienen la correlación más positiva con AD (rojo). El valor de P corregido por BH transformado logarítmicamente indica el grado de significación estadística de cada correlación. (C) Módulos superpuestos significativos con enriquecimiento de tipo celular compartido. (D) Análisis de correlación del cambio de log2 veces de la proteína marcada (eje x) y el ARN (eje y) en el módulo superpuesto. Se muestra el coeficiente de correlación de Pearson con el valor P relevante. Micro, microglía; cuerpos celestes, astrocitos. TAC, control.
La mayoría de los módulos de proteínas y ARN superpuestos comparten perfiles de enriquecimiento de tipo celular similares y direcciones de cambio de AD consistentes (Figura 3, B y C). En otras palabras, el módulo M1 del proteoma cerebral (PM1) relacionado con la sinapsis está asignado a tres módulos de ARN homólogos ricos en neuronas (R-M1, R-M9 y R-M16), que se encuentran en la EA. un nivel reducido. De manera similar, los módulos de proteínas M5 y M18, ricos en glial, se superponen con módulos de ARN ricos en astrocitos y marcadores microgliales (R-M3, R-M7 y R-M10) y están muy involucrados en el aumento de enfermedades. Estas características modulares compartidas entre los dos conjuntos de datos respaldan aún más el enriquecimiento del tipo de célula y los cambios relacionados con la enfermedad que hemos observado en el proteoma cerebral. Sin embargo, observamos muchas diferencias significativas entre los niveles de ARN y proteína de marcadores individuales en estos módulos compartidos. El análisis de correlación de la expresión diferencial de la proteómica y transcriptómica de las moléculas dentro de estos módulos superpuestos (Figura 3D) resalta esta inconsistencia. Por ejemplo, APP y varias otras proteínas del módulo glial (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 y SFRP1) mostraron un aumento significativo en el proteoma de AD, pero casi no hubo cambios en el transcriptoma de AD. Estos cambios específicos de proteínas pueden estar estrechamente relacionados con las placas amiloides (23, 35), destacando el proteoma como la fuente de cambios patológicos, y estos cambios pueden no reflejarse en el transcriptoma.
Después de analizar de forma independiente los proteomas del cerebro y del LCR que descubrimos, realizamos un análisis exhaustivo de los dos conjuntos de datos para identificar biomarcadores del LCR de la EA relacionados con la fisiopatología de la red cerebral. Primero debemos definir la superposición de los dos proteomas. Aunque está ampliamente aceptado que el LCR refleja cambios neuroquímicos en el cerebro con EA (4), no está claro el grado exacto de superposición entre el cerebro con EA y el proteoma del LCR. Al comparar el número de productos genéticos compartidos detectados en nuestros dos proteomas, encontramos que casi el 70% (n = 1936) de las proteínas identificadas en el líquido cefalorraquídeo también se cuantificaron en el cerebro (Figura 4A). La mayoría de estas proteínas superpuestas (n = 1721) están asignadas a uno de los 44 módulos de coexpresión del conjunto de datos del cerebro del descubrimiento (Figura 4B). Como se esperaba, los seis módulos cerebrales más grandes (M1 a M6) exhibieron la mayor cantidad de superposición del LCR. Sin embargo, hay módulos cerebrales más pequeños (por ejemplo, M15 y M29) que logran un grado de superposición inesperadamente alto, más grande que un módulo cerebral del doble de su tamaño. Esto nos motiva a adoptar un método más detallado y basado en estadísticas para calcular la superposición entre el cerebro y el líquido cefalorraquídeo.
(A y B) Las proteínas detectadas en el cerebro del descubrimiento y los conjuntos de datos del LCR se superponen. La mayoría de estas proteínas superpuestas están asociadas con uno de los 44 módulos de coexpresión de la red de coexpresión del cerebro. (C) Descubra la superposición entre el proteoma del líquido cefalorraquídeo y el proteoma de la red cerebral. Cada fila del mapa de calor representa un análisis de superposición separado del FET hipergeométrico. La fila superior muestra la superposición (sombreado gris/negro) entre el módulo cerebral y todo el proteoma del LCR. La segunda línea muestra que la superposición entre los módulos cerebrales y la proteína del LCR (sombreada en rojo) está regulada significativamente en la EA (P <0,05). La tercera fila muestra que la superposición entre los módulos cerebrales y la proteína del LCR (sombreado en azul) está significativamente regulada a la baja en la EA (P <0,05). Utilice el método BH para corregir el valor P derivado del FET. (D) Panel de módulo plegable basado en la asociación del tipo de célula y términos GO relacionados. Estos paneles contienen un total de 271 proteínas relacionadas con el cerebro, que tienen una expresión diferencial significativa en el proteoma del LCR.
Utilizando FET de una sola cola, evaluamos la importancia de la superposición de proteínas entre el proteoma del LCR y los módulos cerebrales individuales. El análisis reveló que un total de 14 módulos cerebrales en el conjunto de datos del LCR tienen superposiciones estadísticamente significativas (P ajustada por FDR <0,05), y un módulo adicional (M18) cuya superposición es cercana a la significancia (P ajustada por FDR = 0,06) (Figura 4C , fila superior). También estamos interesados en módulos que se superpongan fuertemente con proteínas del LCR expresadas diferencialmente. Por lo tanto, aplicamos dos análisis FET adicionales para determinar cuál de (i) la proteína del LCR aumentó significativamente en la EA y (ii) la proteína del LCR disminuyó significativamente en la EA (P <0,05, prueba t pareada AD/control) Módulos cerebrales con superposición significativa entre ellos. Como se muestra en las filas media e inferior de la Figura 4C, estos análisis adicionales muestran que 8 de los 44 módulos cerebrales se superponen significativamente con la proteína agregada en AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 y M38). . ), mientras que solo dos módulos (M6 y M15) mostraron una superposición significativa con la proteína reducida en AD CSF. Como era de esperar, los 10 módulos se encuentran en los 15 módulos con mayor superposición con el proteoma del LCR. Por lo tanto, asumimos que estos 15 módulos son fuentes de alto rendimiento de biomarcadores del LCR derivados del cerebro de la EA.
Plegamos estos 15 módulos superpuestos en cinco grandes paneles de proteínas en función de su proximidad en el diagrama de árbol WGCNA y su asociación con los tipos de células y la ontología genética (Figura 4D). El primer panel contiene módulos ricos en marcadores neuronales y proteínas relacionadas con la sinapsis (M1 y M12). El panel sináptico contiene un total de 94 proteínas y los niveles en el proteoma del LCR han cambiado significativamente, lo que lo convierte en la mayor fuente de marcadores del LCR relacionados con el cerebro entre los cinco paneles. El segundo grupo (M6 y M15) demostró la estrecha conexión con los marcadores de células endoteliales y el cuerpo vascular, como la "cicatrización de heridas" (M6) y la "regulación de la respuesta inmune humoral" (M15). M15 también está altamente relacionado con el metabolismo de las lipoproteínas, que está estrechamente relacionado con el endotelio (36). El panel vascular contiene 34 marcadores del LCR relacionados con el cerebro. El tercer grupo incluye módulos (M2 y M4) que están significativamente relacionados con marcadores de oligodendrocitos y proliferación celular. Por ejemplo, los términos ontológicos de alto nivel de M2 incluyen “regulación positiva de la replicación del ADN” y “proceso de biosíntesis de purinas”. Mientras tanto, los de M4 incluyen “diferenciación de células gliales” y “segregación cromosómica”. El panel de mielinización contiene 49 marcadores del LCR relacionados con el cerebro.
El cuarto grupo contiene la mayoría de los módulos (M30, M29, M18, M24 y M5), y casi todos los módulos son significativamente ricos en marcadores de microglía y astrocitos. Al igual que el panel de mielinización, el cuarto panel también contiene módulos (M30, M29 y M18) que están estrechamente relacionados con la proliferación celular. Los otros módulos de este grupo están muy relacionados con términos inmunológicos, como “proceso de efecto inmunológico” (M5) y “regulación de la respuesta inmune” (M24). El grupo inmune glial contiene 42 marcadores del LCR relacionados con el cerebro. Finalmente, el último panel incluye 52 marcadores relacionados con el cerebro en los cuatro módulos (M44, M3, M33 y M38), todos los cuales están en el cuerpo relacionados con el almacenamiento de energía y el metabolismo. El mayor de estos módulos (M3) está estrechamente relacionado con las mitocondrias y es rico en marcadores neuronales específicos. M38 es uno de los miembros del módulo más pequeños de este metaboloma y también exhibe una especificidad neuronal moderada.
En general, estos cinco paneles reflejan una amplia gama de tipos de células y funciones en la corteza de la EA y, en conjunto, contienen 271 marcadores del LCR relacionados con el cerebro (Tabla S2G). Para evaluar la validez de estos resultados de EM, utilizamos el ensayo de extensión de proximidad (PEA), una tecnología basada en anticuerpos ortogonales con capacidades de multiplexación, alta sensibilidad y especificidad, y volvimos a analizar las muestras de líquido cefalorraquídeo que encontramos. Un subconjunto de estos 271 biomarcadores (n=36). Estos 36 objetivos demuestran el cambio en el múltiplo AD de PEA, que está estrechamente relacionado con nuestros hallazgos basados en EM (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), lo que verificó firmemente los resultados de nuestro análisis integral de EM (Figura S4 ).
Los temas biológicos enfatizados por nuestros cinco grupos, desde la señalización sináptica hasta el metabolismo energético, están todos relacionados con la patogénesis de la EA (1-3). Por lo tanto, los 15 módulos que contienen estos paneles están relacionados con la patología de la EA en el proteoma cerebral que descubrimos (Figura 2B). La más notable es la alta correlación patológica positiva entre nuestros módulos gliales y la fuerte correlación patológica negativa entre nuestros módulos neuronales más grandes (M1 y M3). El análisis de expresión diferencial de nuestro proteoma cerebral replicado (Figura S3D) también destaca las proteínas gliales derivadas de M5 y M18. En AsymAD y AD sintomática, las proteínas gliales más elevadas y las sinapsis relacionadas con M1 son las que más se reducen. Estas observaciones indican que los 271 marcadores del líquido cefalorraquídeo que identificamos en los cinco grupos están relacionados con procesos patológicos en la corteza de la EA, incluidos aquellos que ocurren en las primeras etapas asintomáticas.
Para analizar mejor la dirección del cambio de las proteínas del panel en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo, dibujamos lo siguiente para cada uno de los 15 módulos superpuestos: (i) encontramos el nivel de abundancia del módulo en el conjunto de datos del cerebro y (ii) el módulo proteína La diferencia se expresa en el líquido cefalorraquídeo (Figura S5). Como se mencionó anteriormente, WGCNA se utiliza para determinar la abundancia del módulo o el valor característico de la proteína en el cerebro (13). El mapa del volcán se utiliza para describir la expresión diferencial de proteínas modulares en el líquido cefalorraquídeo (AD/control). Estas cifras muestran que tres de los cinco paneles muestran diferentes tendencias de expresión en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo. Los dos módulos del panel de sinapsis (M1 y M12) muestran una disminución en el nivel de abundancia en el cerebro con EA, pero se superponen significativamente con el aumento de proteína en el LCR de la EA (Figura S5A). Los módulos relacionados con las neuronas que contienen el metaboloma (M3 y M38) mostraron patrones de expresión similares en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo inconsistentes (Figura S5E). El panel vascular también mostró diferentes tendencias de expresión, aunque sus módulos (M6 y M15) aumentaron moderadamente en el cerebro con EA y disminuyeron en el LCR enfermo (Figura S5B). Los dos paneles restantes contienen grandes redes gliales cuyas proteínas están reguladas constantemente en ambos compartimentos (Figura S5, C y D).
Tenga en cuenta que estas tendencias no son comunes a todos los marcadores de estos paneles. Por ejemplo, el panel sináptico incluye varias proteínas que se reducen significativamente en el cerebro con EA y en el LCR (Figura S5A). Entre estos marcadores de líquido cefalorraquídeo regulados negativamente se encuentran NPTX2 y VGF de M1, y la cromogranina B de M12. Sin embargo, a pesar de estas excepciones, la mayoría de nuestros marcadores sinápticos están elevados en el líquido cefalorraquídeo de la EA. En general, estos análisis pudieron distinguir tendencias estadísticamente significativas en los niveles de cerebro y líquido cefalorraquídeo en cada uno de nuestros cinco paneles. Estas tendencias resaltan la relación compleja y a menudo diferente entre la expresión de proteínas del cerebro y del LCR en la EA.
Luego, utilizamos un análisis de replicación de MS de alto rendimiento (replicación 1 del LCR) para limitar nuestro conjunto de 271 biomarcadores a los objetivos más prometedores y reproducibles (Figura 5A). La copia 1 del LCR contiene un total de 96 muestras de Emory Goizueta ADRC, incluido el control, AsymAD y la cohorte AD (Tabla S1A). Estos casos de EA se caracterizan por un deterioro cognitivo leve (MoCA medio, 20,0 ± 3,8) y cambios en los biomarcadores de EA confirmados en el líquido cefalorraquídeo (Tabla S1A). A diferencia del análisis de LCR que encontramos, esta replicación se realiza utilizando un método de MS de "disparo único" más eficiente y de alto rendimiento (sin fraccionamiento fuera de línea), que incluye un protocolo de preparación de muestras simplificado que elimina la necesidad de inmunodepleción de muestras individuales. . En cambio, se utiliza un único "canal de mejora" inmunodeprimido para amplificar la señal de proteínas menos abundantes (37). Aunque reduce la cobertura total del proteoma, este método de disparo único reduce significativamente el tiempo de la máquina y aumenta la cantidad de muestras marcadas con TMT que pueden analizarse de manera viable (17, 38). En total, el análisis identificó 6.487 péptidos, que se asignaron a 1.183 proteomas en 96 casos. Al igual que con el análisis del LCR que encontramos, solo aquellas proteínas cuantificadas en al menos el 50% de las muestras se incluyeron en los cálculos posteriores, y los datos se retrocedieron para determinar los efectos de la edad y el sexo. Esto llevó a la cuantificación final de 792 proteomas, el 95% de los cuales también se identificaron en el conjunto de datos del LCR encontrado.
(A) Objetivos de proteínas del LCR relacionados con el cerebro verificados en la primera cohorte de LCR replicada e incluidos en el panel final (n = 60). (B a E) Niveles de biomarcadores del panel (puntuaciones z compuestas) medidos en las cuatro cohortes de replicación del LCR. Se utilizaron pruebas t pareadas o ANOVA con corrección posterior de Tukey para evaluar la significación estadística de los cambios en la abundancia en cada análisis replicado. TAC, control.
Dado que estamos particularmente interesados en verificar nuestros 271 objetivos de LCR relacionados con el cerebro mediante un análisis exhaustivo, limitaremos un examen más detallado de este proteoma replicado a estos marcadores. Entre estas 271 proteínas, 100 se detectaron en la replicación 1 del LCR. La Figura S6A muestra la expresión diferencial de estos 100 marcadores superpuestos entre las muestras de control y de replicación de AD. Las histonas sinápticas y de los metabolitos aumentan más en la EA, mientras que las proteínas vasculares son las que más disminuyen en la enfermedad. La mayoría de los 100 marcadores superpuestos (n = 70) mantuvieron la misma dirección de cambio en los dos conjuntos de datos (Figura S6B). Estos 70 marcadores de LCR validados relacionados con el cerebro (Tabla S2H) reflejan en gran medida las tendencias de expresión del panel observadas anteriormente, es decir, la regulación negativa de las proteínas vasculares y la regulación positiva de todos los demás paneles. Sólo 10 de estas 70 proteínas validadas mostraron cambios en la abundancia de AD que contradecían estas tendencias del panel. Para generar un panel que refleje mejor la tendencia general del cerebro y el líquido cefalorraquídeo, excluimos estas 10 proteínas del panel de interés que finalmente verificamos (Figura 5A). Por lo tanto, nuestro panel incluye en última instancia un total de 60 proteínas verificadas en dos cohortes independientes de LCR AD utilizando diferentes preparaciones de muestras y análisis de plataformas de EM. Los gráficos de expresión de puntuación z de estos paneles finales en el control de la copia 1 del LCR y los casos de EA confirmaron la tendencia del panel observada en la cohorte de LCR que encontramos (Figura 5B).
Entre estas 60 proteínas, hay moléculas que se sabe que están asociadas con la EA, como la osteopontina (SPP1), que es una citocina proinflamatoria que se ha asociado con la EA en muchos estudios (39-41), y GAP43, una proteína sináptica. eso está claramente relacionado con la neurodegeneración (42). Las proteínas mejor verificadas son marcadores relacionados con otras enfermedades neurodegenerativas, como la superóxido dismutasa 1 (SOD1) relacionada con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y la desacacarasa relacionada con la enfermedad de Parkinson (PARK7). También hemos verificado que muchos otros marcadores, como SMOC1 y la proteína 1 de señalización de unión a membrana rica en cerebro (BASP1), tienen vínculos previos limitados con la neurodegeneración. Vale la pena señalar que debido a su baja abundancia general en el proteoma del LCR, nos resulta difícil utilizar este método de detección de disparo único de alto rendimiento para detectar de manera confiable MAPT y algunas otras proteínas relacionadas con la EA (por ejemplo, NEFL y NRGN). ) (43, 44).
Luego verificamos estos 60 marcadores de panel de prioridad en tres análisis replicados adicionales. En CSF Copy 2, utilizamos un único TMT-MS para analizar una cohorte independiente de 297 muestras de control y AD de Emory Goizueta ADRC (17). La replicación 3 del LCR incluyó un nuevo análisis de los datos de TMT-MS disponibles de 120 pacientes de control y con EA de Lausana, Suiza (45). Detectamos más de dos tercios de los 60 marcadores de prioridad en cada conjunto de datos. Aunque el estudio suizo utilizó diferentes plataformas de MS y métodos de cuantificación de TMT (45, 46), reproducimos firmemente las tendencias de nuestro panel en dos análisis repetidos (Figura 5, C y D, y Tablas S2, I y J). Para evaluar la especificidad de la enfermedad de nuestro grupo, utilizamos TMT-MS para analizar el cuarto conjunto de datos de replicación (replicación 4 del LCR), que incluía no solo casos de control (n = 18) y EA (n = 17), sino también casos de EP ( n = 14)), muestras de ELA (n = 18) y demencia frontotemporal (DFT) (n = 11) (Tabla S1A). Cuantificamos con éxito casi dos tercios de las proteínas del panel en esta cohorte (38 de 60). Estos resultados resaltan los cambios específicos de la EA en los cinco paneles de biomarcadores (Figura 5E y Tabla S2K). El aumento en el grupo de metabolitos mostró la mayor especificidad de EA, seguido por el grupo de mielinización y glial. En menor medida, FTD también muestra un aumento entre estos paneles, lo que puede reflejar cambios potenciales similares en la red (17). Por el contrario, la ELA y la EP mostraron casi los mismos perfiles de mielinización, glial y metaboloma que el grupo de control. En general, a pesar de las diferencias en la preparación de muestras, la plataforma MS y los métodos de cuantificación TMT, estos análisis repetidos muestran que nuestros marcadores de panel prioritarios tienen cambios específicos de EA altamente consistentes en más de 500 muestras únicas de LCR.
La neurodegeneración de la EA ha sido ampliamente reconocida varios años antes de la aparición de los síntomas cognitivos, por lo que existe una necesidad urgente de biomarcadores de AsymAD (5, 31). Sin embargo, cada vez hay más evidencia que muestra que la biología de AsymAD está lejos de ser homogénea, y que la compleja interacción entre riesgo y resiliencia conduce a grandes diferencias individuales en la progresión posterior de la enfermedad (47). Aunque se utilizan para identificar casos de AsymAD, los niveles de los biomarcadores centrales del LCR (Aβ1-42, tau total y p-tau) no han demostrado ser capaces de predecir de manera confiable quién progresará a demencia (4, 7), lo que indica que puede ser más Es necesario incluir herramientas holísticas de biomarcadores basadas en múltiples aspectos de la fisiología cerebral para estratificar con precisión el riesgo de esta población. Por lo tanto, posteriormente analizamos nuestro panel de biomarcadores validados por AD en la población AsymAD de la copia 1 del LCR. Estos 31 casos de AsymAD mostraron niveles anormales de biomarcadores centrales (relación ELISA Aβ1–42/tau total, <5,5) y cognición completa (MoCA media, 27,1). ± 2,2) (Tabla S1A). Además, todos los individuos con AsymAD tienen una puntuación clínica de demencia de 0, lo que indica que no hay evidencia de una disminución en el rendimiento cognitivo o funcional diario.
Primero analizamos los niveles de los paneles validados en las 96 réplicas 1 del LCR, incluida la cohorte AsymAD. Encontramos que varios paneles en el grupo AsymAD tuvieron cambios significativos en la abundancia similares a los de AD, el panel vascular mostró una tendencia a la baja en AsymAD, mientras que todos los demás paneles mostraron una tendencia ascendente (Figura 6A). Por lo tanto, todos los paneles mostraron una correlación altamente significativa con ELISA Aβ1-42 y los niveles totales de tau (Figura 6B). Por el contrario, la correlación entre el grupo y la puntuación MoCA es relativamente pobre. Uno de los hallazgos más sorprendentes de estos análisis es la amplia gama de abundancias del panel en la cohorte AsymAD. Como se muestra en la Figura 6A, el nivel de panel del grupo AsymAD generalmente cruza el nivel de panel del grupo de control y el grupo AD, mostrando una variabilidad relativamente alta. Para explorar más a fondo esta heterogeneidad de AsymAD, aplicamos el análisis de escala multidimensional (MDS) a 96 casos de replicación 1 del LCR. El análisis MDS permite visualizar la similitud entre casos en función de ciertas variables en el conjunto de datos. Para este análisis de conglomerados, solo utilizamos aquellos marcadores de panel validados que tienen un cambio estadísticamente significativo (P <0,05, AD/control) en el nivel de descubrimiento y replicación del proteoma 1 del LCR (n = 29) (Tabla S2L). Este análisis produjo una clara agrupación espacial entre nuestro control y los casos de EA (Figura 6C). Por el contrario, algunos casos de AsymAD están claramente agrupados en el grupo de control, mientras que otros se ubican en casos de EA. Para explorar más a fondo esta heterogeneidad de AsymAD, utilizamos nuestro mapa MDS para definir dos grupos de estos casos de AsymAD. El primer grupo incluyó casos de AsymAD agrupados más cerca del control (n = 19), mientras que el segundo grupo se caracterizó por casos de AsymAD con un perfil de marcador más cercano al de EA (n = 12).
(A) El nivel de expresión (puntuación z) del grupo de biomarcadores del LCR en las 96 muestras de la cohorte de replicación 1 del LCR, incluido AsymAD. Se utilizó el análisis de varianza con la corrección posterior de Tukey para evaluar la significación estadística de los cambios de abundancia del panel. (B) Análisis de correlación del nivel de abundancia de proteínas del panel (puntuación z) con la puntuación MoCA y el nivel de tau total en muestras ELISA Aβ1-42 y copia 1 de LCR. Se muestra el coeficiente de correlación de Pearson con el valor P relevante. (C) El MDS de 96 casos de copia 1 de LCR se basó en los niveles de abundancia de 29 marcadores de panel validados, que cambiaron significativamente tanto en el conjunto de datos de descubrimiento como en la copia 1 de LCR [P <0,05 AD/control (CT)]. Este análisis se utilizó para dividir el grupo AsymAD en subgrupos de control (n = 19) y AD (n = 12). (D) El gráfico del volcán muestra la expresión diferencial de todas las proteínas de replicación 1 del LCR con un cambio de log2 veces (eje x) en relación con el valor estadístico de P -log10 entre los dos subgrupos de AsymAD. Los biomarcadores del panel están coloreados. (E) El nivel de abundancia de replicación 1 del LCR de los biomarcadores del grupo de selección se expresa diferencialmente entre los subgrupos de AsymAD. Se utilizó el análisis de varianza posajustado de Tukey para evaluar la significación estadística.
Examinamos la expresión diferencial de proteínas entre estos casos de control y AsymAD similares a AD (Figura 6D y Tabla S2L). El mapa de volcanes resultante muestra que 14 marcadores de paneles han cambiado significativamente entre los dos grupos. La mayoría de estos marcadores son miembros de la sinapsis y el metaboloma. Sin embargo, SOD1 y el sustrato de proteína quinasa C rico en alanina miristoilada (MARCKS), que son miembros de los grupos inmunes de mielina y glial, respectivamente, también pertenecen a este grupo (Figura 6, D y E). El panel vascular también contribuyó con dos marcadores que se redujeron significativamente en el grupo AsymAD similar a AD, incluida la proteína de unión a AE 1 (AEBP1) y el miembro de la familia del complemento C9. No hubo diferencias significativas entre los subgrupos de control y AsymAD similar a AD en ELISA AB1-42 (P = 0,38) y p-tau (P = 0,28), pero sí hubo una diferencia significativa en el nivel total de tau (P = 0,0031 ) (Figura S7). Hay varios marcadores de panel que indican que los cambios entre los dos subgrupos de AsymAD son más significativos que los niveles totales de tau (por ejemplo, YWHAZ, SOD1 y MDH1) (Figura 6E). En general, estos resultados indican que nuestro panel validado puede contener biomarcadores que pueden subtipificar y estratificar el riesgo potencial de pacientes con enfermedad asintomática.
Existe una necesidad urgente de herramientas de biomarcadores basadas en sistemas para medir y abordar mejor las diversas fisiopatologías detrás de la EA. Se espera que estas herramientas no sólo cambien nuestro marco de diagnóstico de la EA, sino que también promuevan la adopción de estrategias de tratamiento eficaces y específicas para cada paciente (1, 2). Con este fin, aplicamos un enfoque proteómico integral imparcial al cerebro con EA y al LCR para identificar biomarcadores del LCR basados en la web que reflejen una amplia gama de fisiopatología cerebral. Nuestro análisis produjo cinco paneles de biomarcadores del LCR, que (i) reflejan sinapsis, vasos sanguíneos, mielina, disfunción inmune y metabólica; (ii) demostrar una fuerte reproducibilidad en diferentes plataformas de MS; (iii) Mostrar cambios progresivos específicos de la enfermedad a lo largo de las etapas tempranas y tardías de la EA. En general, estos hallazgos representan un paso prometedor hacia el desarrollo de herramientas de biomarcadores diversas, confiables y orientadas a la web para la investigación y aplicaciones clínicas de la EA.
Nuestros resultados demuestran la organización altamente conservada del proteoma de la red cerebral de la EA y respaldan su uso como ancla para el desarrollo de biomarcadores basados en sistemas. Nuestro análisis muestra que dos conjuntos de datos TMT-MS independientes que contienen cerebros AD y AsymAD tienen una fuerte modularidad. Estos hallazgos amplían nuestro trabajo anterior, demostrando la preservación de los poderosos módulos de más de 2000 tejidos cerebrales de múltiples cohortes independientes en la corteza frontal, parietal y temporal (17). Esta red de consenso refleja varios cambios relacionados con la enfermedad observados en la investigación actual, incluido el aumento de módulos inflamatorios ricos en gliales y la disminución de módulos ricos en neuronas. Al igual que la investigación actual, esta red a gran escala también presenta cambios modulares significativos en AsymAD, que muestran una variedad de fisiopatología preclínica diferente (17).
Sin embargo, dentro de este marco sistémico altamente conservador, existe una heterogeneidad biológica más detallada, especialmente entre individuos en las primeras etapas de la EA. Nuestro panel de biomarcadores puede representar dos subgrupos en AsymAD, que demuestran la expresión diferencial significativa de múltiples marcadores del LCR. Nuestro grupo pudo resaltar las diferencias biológicas entre estos dos subgrupos, que no eran obvias a nivel de los biomarcadores centrales de la EA. En comparación con el grupo de control, las proporciones Aβ1-42/tau total de estos individuos AsymAD fueron anormalmente bajas. Sin embargo, sólo los niveles totales de tau fueron significativamente diferentes entre los dos subgrupos de AsymAD, mientras que los niveles de Aβ1-42 y p-tau permanecieron relativamente comparables. Dado que la tau alta en el LCR parece ser un mejor predictor de los síntomas cognitivos que los niveles de Aβ1-42 (7), sospechamos que las dos cohortes de AsymAD pueden tener diferentes riesgos de progresión de la enfermedad. Dado el tamaño limitado de la muestra de nuestro AsymAD y la falta de datos longitudinales, se necesita más investigación para sacar estas conclusiones con confianza. Sin embargo, estos resultados indican que un panel de LCR basado en un sistema puede mejorar nuestra capacidad para estratificar eficazmente a los individuos durante la etapa asintomática de la enfermedad.
En general, nuestros hallazgos respaldan el papel de múltiples funciones biológicas en la patogénesis de la EA. Sin embargo, el metabolismo energético desregulado se convirtió en el tema destacado de nuestros cinco paneles de etiquetado validados. Las proteínas metabólicas, como la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1) y la lactato deshidrogenasa A (LDHA), son los biomarcadores sinápticos más sólidamente validados, lo que indica que el aumento en el LCR de AD es sexual altamente reproducible. Nuestros vasos sanguíneos y paneles gliales también contienen varios marcadores implicados en el metabolismo de sustancias oxidativas. Estos hallazgos son consistentes con el papel clave que desempeñan los procesos metabólicos en todo el cerebro, no sólo para satisfacer la alta demanda de energía de las neuronas, sino también para satisfacer la alta demanda de energía de los astrocitos y otras células gliales (17, 48). Nuestros resultados respaldan la creciente evidencia de que los cambios en el potencial redox y la interrupción de las vías de energía pueden ser el vínculo central entre varios procesos clave involucrados en la patogénesis de la EA, incluidos los trastornos mitocondriales, la inflamación mediada por la glía y el daño vascular (49). Además, los biomarcadores metabólicos del líquido cefalorraquídeo contienen una gran cantidad de proteínas diferencialmente ricas entre nuestro control y los subgrupos AsymAD similares a AD, lo que sugiere que la interrupción de estas vías energéticas y redox puede ser crítica en la etapa preclínica de la enfermedad.
Las diferentes tendencias en los paneles de cerebro y líquido cefalorraquídeo que hemos observado también tienen implicaciones biológicas interesantes. Las sinapsis y los metabolomas ricos en neuronas muestran niveles reducidos en el cerebro con EA y una mayor abundancia en el líquido cefalorraquídeo. Dado que las neuronas son ricas en mitocondrias productoras de energía en las sinapsis para proporcionar energía para sus numerosas señales especializadas (50), se espera la similitud de los perfiles de expresión de estos dos grupos de neuronas. La pérdida de neuronas y la extrusión de células dañadas pueden explicar estas tendencias del panel del cerebro y del LCR en enfermedades posteriores, pero no pueden explicar los cambios tempranos del panel que observamos (13). Una posible explicación para estos hallazgos en la enfermedad asintomática temprana es la poda sináptica anormal. Nuevas pruebas en modelos de ratón sugieren que la fagocitosis sináptica mediada por microglía puede activarse de forma anormal en la EA y provocar una pérdida temprana de sinapsis en el cerebro (51). Este material sináptico desechado puede acumularse en el LCR, por lo que observamos el aumento de LCR en el panel de neuronas. La poda sináptica inmunomediada también puede explicar parcialmente el aumento de proteínas gliales que observamos en el cerebro y el líquido cefalorraquídeo durante todo el proceso de la enfermedad. Además de la poda sináptica, las anomalías generales en la vía exocítica también pueden conducir a diferentes expresiones de marcadores neuronales en el cerebro y el LCR. Varios estudios han demostrado que el contenido de exosomas en la patogénesis del cerebro con EA ha cambiado (52). La vía extracelular también participa en la proliferación de Aβ (53, 54). Vale la pena señalar que la supresión de la secreción exosomal puede reducir la patología similar a la EA en modelos de ratones transgénicos con EA (55).
Al mismo tiempo, la proteína en el panel vascular mostró un aumento moderado en el cerebro con EA, pero disminuyó significativamente en el LCR. La disfunción de la barrera hematoencefálica (BHE) puede explicar en parte estos hallazgos. Muchos estudios independientes post mortem en humanos han demostrado la degradación de la BHE en la EA (56, 57). Estos estudios confirmaron diversas actividades anormales que rodean esta capa herméticamente sellada de células endoteliales, incluida la fuga de capilares cerebrales y la acumulación perivascular de proteínas transmitidas por la sangre (57). Esto puede proporcionar una explicación simple para las proteínas vasculares elevadas en el cerebro, pero no puede explicar completamente el agotamiento de estas mismas proteínas en el líquido cefalorraquídeo. Una posibilidad es que el sistema nervioso central esté aislando activamente estas moléculas para resolver el problema del aumento de la inflamación y el estrés oxidativo. La reducción de algunas de las proteínas del LCR más graves en este panel, especialmente aquellas involucradas en la regulación de las lipoproteínas, está relacionada con la inhibición de niveles dañinos de inflamación y el proceso neuroprotector de las especies reactivas de oxígeno. Esto es cierto para la paroxonasa 1 (PON1), una enzima fijadora de lipoproteínas responsable de reducir los niveles de estrés oxidativo en la circulación (58, 59). El precursor de alfa-1-microglobulina/bikunina (AMBP) es otro marcador significativamente disminuido del grupo vascular. Es el precursor del transportador de lípidos bikunina, que también participa en la supresión de la inflamación y la protección neurológica (60, 61).
A pesar de varias hipótesis interesantes, la incapacidad de detectar directamente los mecanismos bioquímicos de las enfermedades es una limitación bien conocida del análisis proteómico basado en descubrimientos. Por lo tanto, es necesaria más investigación para definir con seguridad los mecanismos detrás de estos paneles de biomarcadores. Para avanzar hacia el desarrollo de análisis clínicos basados en la EM, la dirección futura también requiere el uso de métodos cuantitativos específicos para la verificación de biomarcadores a gran escala, como la monitorización selectiva o paralela de reacciones (62). Recientemente utilizamos el monitoreo de reacciones paralelas (63) para validar muchos de los cambios en las proteínas del LCR que se describen aquí. Varios objetivos prioritarios del panel se cuantifican con una precisión significativa, incluidos YWHAZ, ALDOA y SMOC1, que se asignan a nuestros paneles de sinapsis, metabolismo e inflamación, respectivamente (63). La adquisición de datos independiente (DIA) y otras estrategias basadas en MS también pueden ser útiles para la verificación de objetivos. Bud y col. (64) Recientemente se demostró que existe una superposición significativa entre los biomarcadores de EA identificados en nuestro conjunto de datos de descubrimiento de LCR y el conjunto de datos independiente DIA-MS, que consta de casi 200 muestras de LCR de tres cohortes europeas diferentes. Estos estudios recientes respaldan el potencial de nuestros paneles para transformarse en una detección confiable basada en MS. La detección tradicional basada en anticuerpos y aptámeros también es importante para un mayor desarrollo de biomarcadores clave de la EA. Debido a la baja abundancia de LCR, es más difícil detectar estos biomarcadores utilizando métodos de EM de alto rendimiento. NEFL y NRGN son dos ejemplos de biomarcadores de LCR de baja abundancia, que se asignan al panel en nuestro análisis integral, pero que no se pueden detectar de manera confiable utilizando nuestra estrategia única de EM. Las estrategias de focalización basadas en múltiples anticuerpos, como la PEA, pueden promover la transformación clínica de estos marcadores.
En general, este estudio proporciona un enfoque proteómico único para la identificación y verificación de biomarcadores de EA en el LCR basados en diferentes sistemas. La optimización de estos paneles de marcadores en cohortes adicionales de EA y plataformas de EM puede resultar prometedora para avanzar en la estratificación y el tratamiento del riesgo de EA. Los estudios que evalúan el nivel longitudinal de estos paneles a lo largo del tiempo también son fundamentales para determinar qué combinación de marcadores estratifica mejor el riesgo de enfermedad temprana y cambios en la gravedad de la enfermedad.
A excepción de las tres muestras copiadas por CSF, todas las muestras de LCR utilizadas en este estudio se recolectaron bajo los auspicios de Emory ADRC o instituciones de investigación estrechamente relacionadas. En estos estudios proteómicos se utilizaron un total de cuatro conjuntos de muestras de LCR de Emory. Se encontró que la cohorte de LCR contenía muestras de 20 controles sanos y 20 pacientes con EA. La copia 1 del LCR incluye muestras de 32 controles sanos, 31 individuos AsymAD y 33 individuos AD. La copia 2 del LCR contiene 147 controles y 150 muestras de AD. La cohorte de replicación 4 del LCR con múltiples enfermedades incluyó 18 muestras de control, 17 de EA, 19 de ELA, 13 de EP y 11 de FTD. Según el acuerdo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Emory, todos los participantes del estudio de Emory obtuvieron el consentimiento informado. Según las Directrices de mejores prácticas para centros de Alzheimer del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento de 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), el líquido cefalorraquídeo se recogió y almacenó mediante punción lumbar. Los pacientes de control y AsymAD y AD recibieron una evaluación cognitiva estandarizada en la Clínica de Neurología Cognitiva Emory o en Goizueta ADRC. Sus muestras de líquido cefalorraquídeo fueron analizadas por INNO-BIA AlzBio3 Luminex para ELISA Aβ1-42, análisis de tau total y p-tau (65). Los valores de ELISA se utilizan para respaldar la clasificación diagnóstica de sujetos según los criterios de corte de biomarcadores de EA establecidos (66, 67). Los datos demográficos y de diagnóstico básicos para otros diagnósticos de LCR (DFT, ELA y EP) también se obtienen de Emory ADRC o instituciones de investigación afiliadas. Los metadatos resumidos de estos casos de Emory CSF se pueden encontrar en la Tabla S1A. Las características de la cohorte de replicación 3 del LCR suizo se han publicado previamente (45).
CSF encontró la muestra. Para aumentar la profundidad de nuestro descubrimiento del conjunto de datos del LCR, se realizó un consumo inmunológico de proteínas en alta abundancia antes de la tripsinización. En resumen, se colocaron 130 µl de LCR de 40 muestras individuales de LCR y un volumen igual (130 µl) de resina de agotamiento de proteína de abundancia High Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372) en una columna de centrifugación (Thermo Fisher Scientific, A89868) a temperatura ambiente. temperatura incubar). Después de centrifugar durante 15 minutos, centrifugar la muestra a 1000 g durante 2 minutos. Se utilizó un dispositivo de filtro ultracentrífugo 3K (Millipore, UFC500396) para concentrar la muestra de efluente centrifugando a 14.000 g durante 30 minutos. Diluir todos los volúmenes de muestra a 75 l con solución salina tamponada con fosfato. La concentración de proteína se evaluó mediante el método del ácido bicinconínico (BCA) según el protocolo del fabricante (Thermo Fisher Scientific). El LCR inmunodeprimido (60 µl) de las 40 muestras se digirió con lisil endopeptidasa (LysC) y tripsina. En resumen, la muestra se redujo y se alquiló con 1,2 µl de tris-2(-carboxietil)-fosfina 0,5 M y 3 µl de cloroacetamida 0,8 M a 90 °C durante 10 minutos, y luego se sonicó en un baño de agua durante 15 minutos. La muestra se diluyó con 193 µl de tampón de urea 8 M [urea 8 M y NaHPO4 100 mM (pH 8,5)] hasta una concentración final de urea 6 M. Se usa LysC (4,5 μg; Wako) para la digestión durante la noche a temperatura ambiente. Luego, la muestra se diluyó con urea 1 M con bicarbonato de amonio (ABC) 50 mM (68). Agregue una cantidad igual (4,5 μg) de tripsina (Promega) y luego incube la muestra durante 12 horas. Acidifique la solución de péptidos digeridos hasta una concentración final de 1 % de ácido fórmico (FA) y 0,1 % de ácido trifluoroacético (TFA) (66), y luego desalinice con una columna Sep-Pak C18 de 50 mg (Waters) como se describió anteriormente (25). . Luego se eluyó el péptido en 1 ml de acetonitrilo (ACN) al 50%. Para estandarizar la cuantificación de proteínas en todos los lotes (25), se combinaron alícuotas de 100 µl de las 40 muestras de LCR para generar una muestra mixta, que luego se dividió en cinco muestras de estándar interno global (GIS) (48). Todas las muestras individuales y los estándares combinados se secan mediante vacío de alta velocidad (Labconco).
LCR copia la muestra. Dayon y sus colegas describieron previamente el agotamiento inmunológico y la digestión de muestras de copia 3 del LCR (45, 46). Las muestras replicadas restantes no estaban inmunodeprimidas individualmente. Digerir estas muestras no extraídas en tripsina como se describió anteriormente (17). Para cada análisis repetido, se reunieron alícuotas de 120 µl del péptido eluido de cada muestra y se dividieron en alícuotas de igual volumen para usarlas como estándar interno global marcado con TMT (48). Todas las muestras individuales y los estándares combinados se secan mediante vacío de alta velocidad (Labconco). Para mejorar la señal de la proteína del LCR de baja abundancia, combinando 125 μl de cada muestra, se preparó una muestra "mejorada" para cada análisis replicado [es decir, una muestra biológica que imita la muestra de investigación, pero la cantidad disponible es mucho más grande (37, 69)] fusionados en una muestra mixta de LCR (17). Luego, la muestra mezclada se eliminó inmunológicamente utilizando 12 ml de resina de eliminación de proteínas de abundancia High Select Top14 (Thermo Fisher Scientific, A36372), se digirió como se describe anteriormente y se incluyó en el etiquetado TMT múltiple posterior.
Hora de publicación: 27 de agosto de 2021