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Los termófilos son microorganismos que prosperan a altas temperaturas. Estudiarlos puede proporcionar información valiosa sobre cómo la vida se adapta a condiciones extremas. Sin embargo, es difícil lograr condiciones de alta temperatura con los microscopios ópticos convencionales. Se han propuesto varias soluciones caseras basadas en calefacción eléctrica resistiva local, pero no existe una solución comercial sencilla. En este artículo, presentamos el concepto de calentamiento láser a microescala sobre el campo de visión del microscopio para proporcionar altas temperaturas para estudios termófilos mientras se mantiene templado el entorno del usuario. El calentamiento a microescala a una intensidad láser moderada se puede lograr utilizando un sustrato recubierto de nanopartículas de oro como absorbente de luz eficiente y biocompatible. Se analizan los posibles efectos de la convección de fluidos a microescala, la retención celular y el movimiento termoforético centrífugo. El método se ha demostrado en dos especies: (i) Geobacillus stearothermophilus, una bacteria termófila activa que se reproduce a aproximadamente 65°C, que hemos observado que germina, crece y nada bajo calentamiento a microescala; (ii) Thiobacillus sp., una arquea óptimamente hipertermófila. a 80°C. Este trabajo allana el camino para la observación sencilla y segura de microorganismos termófilos utilizando herramientas de microscopía modernas y asequibles.
A lo largo de miles de millones de años, la vida en la Tierra ha evolucionado para adaptarse a una amplia gama de condiciones ambientales que a veces se consideran extremas desde nuestra perspectiva humana. En particular, algunos microorganismos termófilos (bacterias, arqueas, hongos) llamados termófilos prosperan en el rango de temperatura de 45°C a 122°C1, 2, 3, 4. Los termófilos viven en diversos ecosistemas, como respiraderos hidrotermales de aguas profundas, fuentes termales o zonas volcánicas. Su investigación ha generado mucho interés en las últimas décadas por al menos dos razones. En primer lugar, podemos aprender de ellos, por ejemplo, cómo los termófilos 5, 6, las enzimas 7, 8 y las membranas 9 son estables a temperaturas tan altas, o cómo los termófilos pueden soportar niveles extremos de radiación10. En segundo lugar, son la base de muchas aplicaciones biotecnológicas importantes1,11,12, como la producción de combustible13,14,15,16, la síntesis química (dihidro, alcoholes, metano, aminoácidos, etc.)17, la biominería18 y los biocatalizadores termoestables7,11. 13. En particular, la actualmente conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR)19 implica una enzima (Taq polimerasa) aislada de la bacteria termófila Thermus Aquaticus, una de las primeras termófilas descubiertas.
Sin embargo, el estudio de los termófilos no es una tarea fácil y no se puede improvisar en ningún laboratorio biológico. En particular, los termófilos vivos no pueden observarse in vitro con ningún microscopio óptico estándar, ni siquiera con cámaras de calentamiento disponibles comercialmente, generalmente clasificadas para temperaturas tan bajas como 40°C. Desde la década de 1990, sólo unos pocos grupos de investigación se han dedicado a la introducción de sistemas de microscopía de alta temperatura (HTM). En 1994, Glukh et al. La cámara de calentamiento/enfriamiento fue concebida a partir del uso de una celda Peltier que controla la temperatura de capilares rectangulares cerrados para mantener la anaerobicidad 20 . El dispositivo se puede calentar hasta 100 °C a una velocidad de 2 °C/s, lo que permite a los autores estudiar la motilidad de la bacteria hipertermófila Thermotoga maritima21. En 1999, Horn et al. Se ha desarrollado un dispositivo muy similar, todavía basado en el uso de capilares calentados adecuados para microscopía comercial para estudiar la división/conexión celular. Después de un largo período de relativa inactividad, la búsqueda de HTM eficaces se reanudó en 2012, en particular en relación con una serie de artículos del grupo Wirth que utilizaba un dispositivo inventado por Horn et al. Hace quince años, se estudió la motilidad de un gran número de arqueas, incluidas las hipertermófilas, a temperaturas de hasta 100 °C utilizando capilares calentados23,24. También modificaron el microscopio original para lograr un calentamiento más rápido (varios minutos en lugar de 35 minutos para alcanzar la temperatura establecida) y lograr un gradiente de temperatura lineal de más de 2 cm en todo el medio. Este dispositivo de conformación de gradiente de temperatura (TGFD) se ha utilizado para estudiar la movilidad de muchos termófilos dentro de gradientes de temperatura a distancias biológicamente relevantes 24, 25.
Calentar capilares cerrados no es la única forma de observar termófilos vivos. En 2012, Kuwabara et al. Se utilizaron cámaras Pyrex desechables caseras selladas con adhesivo resistente al calor (Super X2; Cemedine, Japón). Las muestras se colocaron en una placa calefactora transparente disponible comercialmente (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japón) capaz de calentar hasta 110 °C, pero que originalmente no estaba destinada a la obtención de bioimágenes. Los autores observaron una división eficiente de bacterias termófilas anaeróbicas (Thermosipho globiformans, tiempo de duplicación 24 min) a 65°C. En 2020, Pulshen et al. Se demostró el calentamiento eficiente de platos metálicos comerciales (AttofluorTM, Thermofisher) utilizando dos elementos calefactores caseros: una tapa y una platina (configuración inspirada en una máquina de PCR). Esta asociación da como resultado una temperatura del líquido uniforme y evita la evaporación y la condensación en el fondo de la tapa. El uso de una junta tórica evita el intercambio de gases con el medio ambiente. Este HTM, llamado Sulfoscope, se utilizó para obtener imágenes de Sulfolobus acidocaldarius a 75°C27.
Una limitación reconocida de todos estos sistemas fue la restricción al uso de objetivos aéreos, ya que cualquier inmersión en aceite no era adecuada para temperaturas tan altas y para obtener imágenes a través de muestras transparentes de >1 mm de espesor. Una limitación reconocida de todos estos sistemas fue la restricción al uso de objetivos aéreos, ya que cualquier inmersión en aceite no era adecuada para temperaturas tan altas y para obtener imágenes a través de muestras transparentes de >1 mm de espesor. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольку любое No se debe ajustar la temperatura del aparato ni la visualización cuando el tamaño sea superior a 1 mm. Una deficiencia reconocida de todos estos sistemas fue la limitación al uso de objetivos de aire, ya que cualquier inmersión en aceite no era adecuada para temperaturas tan altas y para la visualización a través de muestras transparentes de > 1 mm de espesor.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1米厚的透明样品成像. Una limitación reconocida de todos estos sistemas es la limitación del uso de un espejo con aire incorporado, ya que cualquier inmersión en aceite no es adecuada para obtener imágenes de muestras transparentes de >1 mm de espesor a temperaturas tan altas. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любое имерсионное Utilice una mayor cantidad de temperatura para visualizar la temperatura y la visualización cuando el tamaño sea superior a 1 mm. Un inconveniente reconocido de todos estos sistemas es el uso limitado de lentes de aire; cualquier inmersión en aceite es inadecuada para temperaturas tan altas y visualización a través de muestras transparentes de >1 mm de espesor.Más recientemente, esta limitación fue eliminada por Charles-Orzag et al. 28, quienes desarrollaron un dispositivo que ya no proporciona calor alrededor del sistema de interés, sino dentro del propio cubreobjetos, cubierto con una fina capa transparente de una resistencia hecha de ITO (óxido de indio-estaño). La tapa se puede calentar hasta 75 °C pasando una corriente eléctrica a través de la capa transparente. Sin embargo, el autor también debe calentar la lente hasta el objetivo, pero no más de 65 °C, para no dañarla.
Estos trabajos muestran que el desarrollo de una microscopía óptica eficiente de alta temperatura no ha sido ampliamente adoptado, a menudo requiere equipos caseros y a menudo se logra a costa de la resolución espacial, lo cual es una seria desventaja dado que los microorganismos termófilos no son más grandes que unos pocos. micrómetros. El volumen de calentamiento reducido es la clave para resolver tres problemas inherentes al HTM: mala resolución espacial, alta inercia térmica cuando el sistema se calienta y calentamiento dañino de los elementos circundantes (aceite de inmersión, lente del objetivo… o manos del usuario) a temperaturas extremas. ).
En este artículo, presentamos un HTM para la observación termófila que no se basa en calentamiento resistivo. En cambio, logramos un calentamiento localizado dentro de una región limitada del campo de visión del microscopio mediante irradiación láser de un sustrato absorbente de luz. La distribución de temperatura se visualizó mediante microscopía de fase cuantitativa (QPM). La eficacia de este método está demostrada por Geobacillus stearothermophilus, una bacteria termófila móvil que se reproduce a unos 65°C y tiene un tiempo de duplicación corto (unos 20 minutos), y Sulfolobus shibatae, una hipertermófila que crece de forma óptima a 80°C (archaea). para ilustrar. Se observó una tasa de replicación y natación normales en función de la temperatura. Este láser HTM (LA-HTM) no está limitado por el espesor del cubreobjetos ni por la naturaleza del objetivo (inmersión en aire o aceite). Esto permite utilizar cualquier lente de alta resolución del mercado. Tampoco sufre un calentamiento lento debido a la inercia térmica (logra un calentamiento instantáneo en una escala de milisegundos) y utiliza únicamente componentes disponibles comercialmente. Las únicas nuevas preocupaciones de seguridad están relacionadas con la presencia de potentes rayos láser (normalmente de hasta 100 mW) dentro del dispositivo y posiblemente a través de los ojos, que requieren gafas protectoras.
El principio de LA-HTM es utilizar un láser para calentar la muestra localmente dentro del campo de visión del microscopio (Fig. 1a). Para ello, la muestra debe absorber la luz. Para utilizar una potencia láser razonable (menos de 100 mW), no confiamos en la absorción de luz por el medio líquido, sino que aumentamos artificialmente la absorción de la muestra recubriendo el sustrato con nanopartículas de oro (Fig. 1c). Calentar nanopartículas de oro con luz es de fundamental importancia para el campo de la plasmónica térmica, con aplicaciones esperadas en biomedicina, nanoquímica o captación de luz solar29,30,31. En los últimos años, hemos utilizado este LA-HTM en varios estudios relacionados con aplicaciones del plasma térmico en física, química y biología. La principal dificultad con este método es mostrar el perfil de temperatura final, ya que la temperatura elevada se limita a una región de microescala dentro de la muestra. Hemos demostrado que se puede lograr un mapeo de temperatura con el interferómetro de corte transversal de cuatro longitudes de onda, un método simple, de alta resolución y muy sensible de microscopía de fase cuantitativa basado en el uso de rejillas de difracción bidimensionales (también conocidas como rejillas cruzadas). 33,34,35,36. La fiabilidad de esta técnica de microscopía térmica, basada en la microscopía de frente de onda de rejilla cruzada (CGM), ha quedado demostrada en una docena de artículos publicados durante la última década37,38,39,40,41,42,43.
Esquema de instalación de un microscopio de temperatura, modelado y calentamiento por láser paralelo. b Geometría de la muestra que consta de una cámara AttofluorTM que contiene un cubreobjetos recubierto con nanopartículas de oro. c Mire de cerca la muestra (no a escala). d representa el perfil uniforme del rayo láser y (e) la distribución de temperatura posterior simulada en el plano de muestra de las nanopartículas de oro. f es un perfil de rayo láser anular adecuado para generar una temperatura uniforme como se muestra en la simulación de la distribución de temperatura resultante que se muestra en (g). Barra de escala: 30 µm.
En particular, recientemente logramos calentar células de mamíferos con LA-HTM y CGM y rastreamos las respuestas de choque térmico celular en el rango de 37-42 °C, lo que demuestra la aplicabilidad de esta técnica a la obtención de imágenes de células vivas individuales. Sin embargo, la aplicación de LA-HTM al estudio de microorganismos a altas temperaturas no es inequívoca, ya que requiere más precaución en comparación con las células de mamíferos: en primer lugar, calentar el fondo del medio decenas de grados (en lugar de unos pocos grados) conduce a un fuerte gradiente vertical de temperatura. puede crear convección de fluido 44 que, si no está firmemente adherida al sustrato, puede causar movimiento y mezcla indeseables de bacterias. Esta convección se puede eliminar reduciendo el espesor de la capa líquida. Para este propósito, en todos los experimentos presentados a continuación, se colocaron suspensiones bacterianas entre dos cubreobjetos de aproximadamente 15 µm de espesor colocados dentro de una copa de metal (AttofluorTM, Thermofisher, Fig. 1b,c). En principio, se puede evitar la convección si el espesor del líquido es menor que el tamaño del haz del láser calefactor. En segundo lugar, trabajar en una geometría tan limitada puede asfixiar a los organismos aeróbicos (ver Fig. S2). Este problema se puede evitar utilizando un sustrato que sea permeable al oxígeno (o cualquier otro gas vital), dejando burbujas de aire atrapadas dentro del cubreobjetos o perforando agujeros en el cubreobjetos superior (ver Fig. S1) 45. En este estudio, elegimos la última solución (Figuras 1b y S1). Finalmente, el calentamiento por láser no proporciona una distribución uniforme de la temperatura. Incluso con la misma intensidad del rayo láser (Fig. 1d), la distribución de temperatura no es uniforme, sino que se parece a la distribución gaussiana debido a la difusión térmica (Fig. 1e). Cuando el objetivo es establecer temperaturas precisas en el campo de visión para estudiar sistemas biológicos, los perfiles desiguales no son ideales y también pueden provocar un movimiento termoforético de las bacterias si no se adhieren al sustrato (ver Fig. S3, S4)39. Para este fin, utilizamos un modulador de luz espacial (SLM) para dar forma al rayo láser infrarrojo de acuerdo con la forma del anillo (Fig. 1f) en el plano de la muestra para lograr una distribución de temperatura perfectamente uniforme dentro de un área geométrica determinada. a pesar de la difusión térmica (Fig. 1d) 39, 42, 46. Coloque un cubreobjetos superior sobre un plato de metal (Figura 1b) para evitar la evaporación del medio y observe durante al menos unos días. Debido a que este cubreobjetos superior no está sellado, se puede agregar fácilmente medio adicional en cualquier momento si es necesario.
Para ilustrar cómo funciona LA-HTM y demostrar su aplicabilidad en la investigación termófila, estudiamos la bacteria aeróbica Geobacillus stearothermophilus, que tiene una temperatura de crecimiento óptima de alrededor de 60-65°C. La bacteria también tiene flagelos y la capacidad de nadar, lo que proporciona otro indicador de la actividad celular normal.
Las muestras (Fig. 1b) se preincubaron a 60 °C durante una hora y luego se colocaron en un portamuestras LA-HTM. Esta preincubación es opcional, pero sigue siendo útil, por dos razones: primero, cuando se enciende el láser, hace que las células crezcan y se dividan inmediatamente (consulte la película M1 en Materiales complementarios). Sin preincubación, el crecimiento bacteriano normalmente se retrasa unos 40 minutos cada vez que se calienta una nueva área de visualización en la muestra. En segundo lugar, la preincubación de 1 hora promovió la adhesión de las bacterias al cubreobjetos, evitando que las células se salgan del campo de visión debido a la termoforesis cuando se enciende el láser (ver película M2 en Materiales complementarios). La termoforesis es el movimiento de partículas o moléculas a lo largo de un gradiente de temperatura, generalmente de caliente a frío, y las bacterias no son una excepción43,47. Este efecto indeseable se elimina en un área determinada utilizando SLM para dar forma al rayo láser y lograr una distribución plana de la temperatura.
En la fig. La Figura 2 muestra la distribución de temperatura medida por CGM obtenida al irradiar un sustrato de vidrio recubierto con nanopartículas de oro con un rayo láser anular (Fig. 1f). Se observó una distribución plana de la temperatura en toda la superficie cubierta por el rayo láser. Esta zona se fijó en 65°C, la temperatura óptima de crecimiento. Fuera de esta región, la curva de temperatura cae naturalmente a \(1/r\) (donde \(r\) es la coordenada radial).
Un mapa de temperatura de las mediciones de CGM obtenidas mediante el uso de un rayo láser anular para irradiar una capa de nanopartículas de oro para obtener un perfil de temperatura plano sobre un área circular. b Isoterma del mapa de temperaturas (a). El contorno del rayo láser está representado por un círculo de puntos gris. El experimento se repitió dos veces (ver Materiales complementarios, Figura S4).
La viabilidad de las células bacterianas se controló durante varias horas utilizando LA-HTM. En la fig. 3 muestra el intervalo de tiempo para cuatro imágenes tomadas de una película de 3 horas y 20 minutos (Película M3, Información complementaria). Se observó que las bacterias proliferaban activamente dentro del área circular definida por el láser donde la temperatura era óptima, acercándose a los 65°C. Por el contrario, el crecimiento celular se redujo significativamente cuando la temperatura cayó por debajo de 50°C durante 10 s.
Imágenes ópticas de profundidad de la bacteria G. stearothermophilus creciendo después del calentamiento con láser en diferentes tiempos, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, de 200 Extraído de una película de un minuto (película M3 proporcionada en Información complementaria) superpuesta al mapa de temperatura correspondiente. El láser se enciende en el tiempo \(t=0\). Se han añadido isotermas a la imagen de intensidad.
Para cuantificar aún más el crecimiento celular y su dependencia de la temperatura, medimos el aumento de biomasa de varias colonias de bacterias inicialmente aisladas en el campo de visión de Movie M3 (Fig. 4). Las bacterias originales seleccionadas al inicio de la formación de la unidad formadora de minicolonias (mCFU) se muestran en la Figura S6. Las mediciones de masa seca se tomaron con una cámara CGM 48 que se utilizó para mapear la distribución de temperatura. La capacidad del CGM para medir el peso seco y la temperatura es el punto fuerte del LA-HTM. Como se esperaba, la alta temperatura provocó un crecimiento bacteriano más rápido (Fig. 4a). Como se muestra en el gráfico semilogarítmico de la figura 4b, el crecimiento a todas las temperaturas sigue un crecimiento exponencial, donde los datos utilizan la función exponencial \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), donde \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – tiempo de generación (o tiempo de duplicación), \( g =1/ \tau\) – tasa de crecimiento (número de divisiones por unidad de tiempo). En la fig. 4c muestra la tasa de crecimiento respectiva y el tiempo de generación en función de la temperatura. Las mCFU de rápido crecimiento se caracterizan por la saturación del crecimiento después de dos horas, un comportamiento esperado debido a la alta densidad bacteriana (similar a la fase estacionaria en los cultivos líquidos clásicos). La forma general \(g\left(T\right)\) (Fig. 4c) corresponde a la curva de dos fases esperada para G. stearothermophilus con una tasa de crecimiento óptima alrededor de 60-65 °C. Haga coincidir los datos usando un modelo cardinal (Figura S5)49 donde \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, lo que concuerda bien con otros valores citados en la literatura49. Aunque los parámetros dependientes de la temperatura son reproducibles, la tasa de crecimiento máxima de \({G}_{0}\) puede variar de un experimento a otro (consulte las figuras S7-S9 y la película M4). A diferencia de los parámetros de ajuste de temperatura, que deberían ser universales, la tasa de crecimiento máxima depende de las propiedades del medio (disponibilidad de nutrientes, concentración de oxígeno) dentro de la geometría de microescala observada.
a Crecimiento microbiano a diversas temperaturas. mCFU: Unidades formadoras de colonias en miniatura. Datos obtenidos de un vídeo de una sola bacteria creciendo en un gradiente de temperatura (película M3). b Igual que (a), escala semilogarítmica. c Tasa de crecimiento\(\tau\) y tiempo de generación\(g\) calculados a partir de la regresión lineal (b). Barras de error horizontales: rango de temperatura sobre el cual las mCFU se expandieron en el campo de visión durante el crecimiento. Barras de error verticales: error estándar de regresión lineal.
Además del crecimiento normal, algunas bacterias a veces flotaban a la vista durante el calentamiento con láser, lo cual es un comportamiento esperado para las bacterias con flagelos. La película M5 en información adicional muestra este tipo de actividades de natación. En este experimento, se utilizó radiación láser uniforme para crear un gradiente de temperatura, como se muestra en las Figuras 1d, ey S3. La Figura 5 muestra dos secuencias de imágenes seleccionadas de la película M5 que muestran que una bacteria exhibe un movimiento direccional mientras que todas las demás bacterias permanecen inmóviles.
Los dos cuadros de tiempo (a) y (b) muestran la natación de dos bacterias diferentes marcadas con círculos de puntos. Las imágenes fueron extraídas de la película M5 (proporcionada como material complementario).
En el caso de G. stearothermophilus, el movimiento activo de las bacterias (Fig. 5) comenzó unos segundos después de que se encendió el rayo láser. Esta observación enfatiza la respuesta temporal de este microorganismo termófilo ante un aumento de temperatura, como ya observaron Mora et al. 24 . El tema de la motilidad bacteriana e incluso la termotaxis se puede explorar más a fondo utilizando LA-HTM.
La natación microbiana no debe confundirse con otros tipos de movimiento físico, a saber (i) el movimiento browniano, que parece ser un movimiento caótico sin dirección definida, (ii) la convección 50 y la termoforesis 43, que consisten en una deriva regular del movimiento a lo largo de una temperatura. gradiente.
G. stearothermophilus es conocido por su capacidad de producir esporas altamente resistentes (formación de esporas) cuando se expone a condiciones ambientales adversas como defensa. Cuando las condiciones ambientales vuelven a ser favorables, las esporas germinan, forman células vivas y reanudan su crecimiento. Aunque este proceso de esporulación/germinación es bien conocido, nunca se ha observado en tiempo real. Utilizando LA-HTM, informamos aquí la primera observación de eventos de germinación en G. stearothermophilus.
En la fig. 6a muestra imágenes de lapso de tiempo de profundidad óptica (OT) obtenidas utilizando un conjunto CGM de 13 esporas. Durante todo el tiempo de recolección (15 h 6 min, \(t=0\) – el comienzo del calentamiento por láser), 4 de 13 esporas germinaron, en puntos de tiempo sucesivos \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' y \(11\) h \(30\)'. Aunque solo uno de estos eventos se muestra en la Figura 6, se pueden observar 4 eventos de germinación en la película M6 del material complementario. Curiosamente, la germinación parece ser aleatoria: no todas las esporas germinan y no germinan al mismo tiempo, a pesar de los mismos cambios en las condiciones ambientales.
a Time-lapse que consta de 8 imágenes OT (inmersión en aceite, 60x, objetivo 1,25 NA) y (b) evolución de la biomasa de agregados de G. stearothermophilus. c (b) Dibujado en una escala semilogarítmica para resaltar la linealidad de la tasa de crecimiento (línea discontinua).
En la fig. 6b,c muestra la biomasa de las poblaciones celulares en el campo de visión en función del tiempo durante todo el período de recopilación de datos. La rápida descomposición de la masa seca observada en \(t=5\)h en la fig. 6b, c, debido a la salida de algunas células del campo de visión. La tasa de crecimiento de estos cuatro eventos es \(0,77\pm 0,1\) h-1. Este valor es mayor que la tasa de crecimiento asociada con la Figura 3. 3 y 4, donde las células crecen normalmente. El motivo del aumento de la tasa de crecimiento de G. stearothermophilus a partir de esporas no está claro, pero estas mediciones resaltan el interés de LA-HTM y trabajan a nivel de una sola célula (o a nivel de mCFU) para aprender más sobre la dinámica de la vida celular. .
Para demostrar aún más la versatilidad de LA-HTM y su rendimiento a altas temperaturas, examinamos el crecimiento de Sulfolobus shibatae, una arquea acidófila hipertermófila con una temperatura óptima de crecimiento de 80 °C51. En comparación con G. stearothermophilus, estas arqueas también tienen una morfología muy diferente, asemejándose a esferas de 1 micrón (cocos) en lugar de bastones alargados (bacilos).
La Figura 7a consta de imágenes secuenciales de profundidad óptica de S. shibatae mCFU obtenidas mediante CGM (consulte el largometraje M7 en Materiales complementarios). Esta mCFU crece alrededor de 73°C, por debajo de la temperatura óptima de 80°C, pero dentro del rango de temperatura para un crecimiento activo. Observamos múltiples eventos de fisión que hicieron que las mCFU parecieran microgramos de arqueas después de unas horas. A partir de estas imágenes de OT, se midió la biomasa de mCFU a lo largo del tiempo y se presentó en la Figura 7b. Curiosamente, las mCFU de S. shibatae mostraron un crecimiento lineal en lugar del crecimiento exponencial observado con las mCFU de G. stearothermophilus. Ha habido una discusión de larga data 52 sobre la naturaleza de las tasas de crecimiento celular: mientras que algunos estudios informan tasas de crecimiento de microbios que son proporcionales a su tamaño (crecimiento exponencial), otros muestran una tasa constante (crecimiento lineal o bilineal). Como explican Tzur et al.53, distinguir entre crecimiento exponencial y (bi)lineal requiere una precisión <6% en las mediciones de biomasa, lo que está fuera del alcance de la mayoría de las técnicas QPM, incluso con interferometría. Como explican Tzur et al.53, distinguir entre crecimiento exponencial y (bi)lineal requiere una precisión <6% en las mediciones de biomasa, lo que está fuera del alcance de la mayoría de las técnicas QPM, incluso con interferometría. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% en измерениях biomassy, что не Para utilizar varios métodos QPM, utilice interferómetros. Como explican Zur et al.53, distinguir entre crecimiento exponencial y (bi)lineal requiere <6% de precisión en las mediciones de biomasa, lo cual es inalcanzable para la mayoría de los métodos QPM, incluso usando interferometría.Como explica Zur et al. 53, distinguir entre crecimiento exponencial y (bi)lineal requiere menos del 6% de precisión en las mediciones de biomasa, lo cual es inalcanzable para la mayoría de los métodos QPM, incluso cuando se utiliza interferometría. CGM logra esta precisión con una precisión inferior a pg en mediciones de biomasa36,48.
a Time-lapse que consta de 6 imágenes OT (inmersión en aceite, 60x, objetivo NA 1,25) y (b) evolución de la biomasa de micro-UFC medida con CGM. Vea la película M7 para obtener más información.
El crecimiento perfectamente lineal de S. shibatae fue inesperado y aún no se ha informado. Sin embargo, se espera un crecimiento exponencial, al menos porque con el tiempo deben ocurrir múltiples divisiones de 2, 4, 8, 16… células. Nuestra hipótesis es que el crecimiento lineal podría deberse a la inhibición celular debida al denso empaquetamiento celular, del mismo modo que el crecimiento celular se ralentiza y eventualmente alcanza un estado latente cuando la densidad celular es demasiado alta.
Concluimos discutiendo sucesivamente los siguientes cinco puntos de interés: reducción del volumen de calentamiento, reducción de la inercia térmica, interés en las nanopartículas de oro, interés en la microscopía de fase cuantitativa y un posible rango de temperatura en el que se puede utilizar LA-HTM.
En comparación con el calentamiento resistivo, el calentamiento láser utilizado para el desarrollo de HTM ofrece varias ventajas, que ilustramos en este estudio. En particular, en medios líquidos en el campo de visión del microscopio, el volumen de calentamiento se mantiene dentro de unos pocos volúmenes (10 μm). De esta manera, solo los microbios observados están activos, mientras que otras bacterias están inactivas y pueden usarse para estudiar más a fondo la muestra; no es necesario cambiar la muestra cada vez que es necesario verificar una nueva temperatura. Además, el calentamiento a microescala permite el examen directo de una amplia gama de temperaturas: la Figura 4c se obtuvo de una película de 3 horas (Película M3), que generalmente requiere la preparación y el examen de varias muestras, una para cada una de las muestras en estudio. y es la temperatura que representa el número de días del experimento. La reducción del volumen calentado también mantiene todos los componentes ópticos circundantes del microscopio, especialmente la lente del objetivo, a temperatura ambiente, lo que ha sido un problema importante al que se ha enfrentado la comunidad hasta ahora. LA-HTM se puede utilizar con cualquier lente, incluidas las lentes de inmersión en aceite, y permanecerá a temperatura ambiente incluso con temperaturas extremas en el campo de visión. La principal limitación del método de calentamiento por láser que informamos en este estudio es que las células que no se adhieren o flotan pueden estar lejos del campo de visión y ser difíciles de estudiar. Una solución alternativa podría ser utilizar lentes de bajo aumento para lograr un aumento de temperatura mayor, superior a unos pocos cientos de micrones. Esta precaución va acompañada de una disminución de la resolución espacial, pero si el objetivo es estudiar el movimiento de microorganismos, no se requiere una alta resolución espacial.
La escala de tiempo para calentar (y enfriar) el sistema \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) depende de su tamaño. según la ley \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), donde \ (L\ ) es el tamaño característico de la fuente de calor (el diámetro del rayo láser en nuestro estudio es \(L\ aproximadamente 100\) μm), \(D\) es la difusividad térmica del ambiente (promedio en nuestro caso, vidrio y agua Velocidad de difusión\(D\ aproximadamente 2\veces {10}^{-7}\) m2/s). Por lo tanto, en este estudio, las respuestas temporales son del orden de 50 ms, es decir, casi instantáneas. Se pueden esperar cambios de temperatura. Este establecimiento instantáneo del aumento de temperatura no solo acorta la duración del experimento, sino que también permite una sincronización precisa \(t=0\) para cualquier estudio dinámico de los efectos de la temperatura.
Nuestro método propuesto es aplicable a cualquier sustrato absorbente de luz (por ejemplo, muestras comerciales con recubrimiento ITO). Sin embargo, las nanopartículas de oro pueden proporcionar una alta absorción en el infrarrojo y una baja absorción en el rango visible, cuyas últimas características son de interés para una observación óptica eficaz en el rango visible, especialmente cuando se utiliza fluorescencia. Además, el oro es biocompatible, químicamente inerte, la densidad óptica se puede ajustar desde 530 nm hasta el infrarrojo cercano y la preparación de muestras es sencilla y económica29.
La microscopía de frente de onda de rejilla transversal (CGM) permite no solo mapear la temperatura a microescala, sino también monitorear la biomasa, lo que la hace particularmente útil (si no necesaria) en combinación con LA-HTM. Durante la última década, se han desarrollado otras técnicas de microscopía de temperatura, especialmente en el campo de la bioimagen, y la mayoría de ellas requieren el uso de sondas fluorescentes sensibles a la temperatura54,55. Sin embargo, estos métodos han sido criticados y algunos informes han medido cambios de temperatura poco realistas dentro de las células, posiblemente debido al hecho de que la fluorescencia depende de muchos factores además de la temperatura. Además, la mayoría de las sondas fluorescentes son inestables a altas temperaturas. Por lo tanto, QPM y en particular CGM representan una técnica de microscopía de temperatura ideal para estudiar la vida a altas temperaturas mediante microscopía óptica.
Los estudios de S. shibatae, que viven de manera óptima a 80°C, muestran que LA-HTM se puede aplicar para estudiar a los hipertermófilos, no solo a los simples termófilos. En principio, no hay límite para el rango de temperaturas que se pueden alcanzar usando LA-HTM, e incluso se pueden alcanzar temperaturas superiores a 100°C a presión atmosférica sin hervir, como lo demostró nuestro grupo de 38 en aplicaciones de química hidrotermal a presión atmosférica. presión A. Se utiliza un láser para calentar nanopartículas de oro 40 de la misma manera. Por lo tanto, LA-HTM tiene el potencial de usarse para observar hipertermófilos sin precedentes con microscopía óptica estándar de alta resolución en condiciones estándar (es decir, bajo estrés ambiental).
Todos los experimentos se realizaron utilizando un microscopio casero, incluida iluminación Köhler (con LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), portamuestras con movimiento xy manual, objetivos (Olympus, 60x, 0,7 NA, aire, LUCPlanFLN60X o 60x, 1,25 NA, aceite , UPLFLN60XOI), cámara CGM (rejilla cruzada QLSI, paso de 39 µm, 0,87 mm del sensor de la cámara Andor Zyla) para proporcionar imágenes de intensidad y frente de onda, y cámara sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, modo de 16 bits, de Hamamatsu) para registrar el datos mostrados en la Figura 5 (natación bacteriana). El divisor de haz dicroico es un borde BrightLine de 749 nm (Semrock, FF749-SDi01). El filtro en la parte frontal de la cámara es un filtro de paso corto 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Láser de zafiro de titanio (Láser Verdi G10, 532 nm, 10 W, cavidad láser bombeada de tsunami, Spectra-Physics en la Fig. 2-5, reemplazado además por láser Millenia, Spectraphysics 10 W, cavidad láser bombeada Mira, Coherent, para la Fig. 2 -5). 6 y 7) están configurados en la longitud de onda \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, que corresponde al espectro de resonancia de plasmón de las nanopartículas de oro. Moduladores de luz espaciales (1920 × 1152 píxeles) se compraron en Meadowlark Optics. Los hologramas se calcularon utilizando el algoritmo de Gerchberg-Saxton como se describe en el enlace 39.
La microscopía de frente de onda de rejilla cruzada (CGM) es una técnica de microscopía óptica basada en la combinación de una rejilla de difracción bidimensional (también conocida como rejilla cruzada) a una distancia de un milímetro del sensor de una cámara convencional. El ejemplo más común de un MCG que hemos utilizado en este estudio se llama interferómetro de desplazamiento transversal de cuatro longitudes de onda (QLSI), donde la rejilla cruzada consiste en un patrón de tablero de ajedrez de intensidad/fase introducido y patentado por Primot et al. en 200034. Las líneas de rejilla verticales y horizontales crean sombras en forma de rejilla en el sensor, cuya distorsión se puede procesar numéricamente en tiempo real para obtener la distorsión del frente de onda óptica (o perfil de fase equivalente) de la luz incidente. Cuando se utiliza en un microscopio, una cámara CGM puede mostrar la diferencia de trayectoria óptica de un objeto fotografiado, también conocida como profundidad óptica (OT), con una sensibilidad del orden de nanómetros36. En cualquier medición de CGM, para eliminar cualquier defecto en los componentes o haces ópticos, se debe tomar una imagen OT de referencia primaria y restarla de cualquier imagen posterior.
La microscopía de temperatura se realizó utilizando una cámara CGM como se describe en la referencia. 32. En resumen, calentar un líquido cambia su índice de refracción, creando un efecto de lente térmica que distorsiona el haz incidente. El CGM mide esta distorsión del frente de onda y la procesa mediante un algoritmo de deconvolución para obtener una distribución de temperatura tridimensional en el medio líquido. Si las nanopartículas de oro se distribuyen uniformemente por toda la muestra, se puede realizar un mapeo de temperatura en áreas libres de bacterias para producir mejores imágenes, que es lo que hacemos a veces. La imagen CGM de referencia se adquirió sin calentamiento (con el láser apagado) y posteriormente se capturó en la misma ubicación de la imagen con el láser encendido.
La medición de la masa seca se logra utilizando la misma cámara CGM que se utiliza para obtener imágenes de temperatura. Las imágenes de referencia de CGM se obtuvieron moviendo rápidamente la muestra en xey durante la exposición como un medio para promediar cualquier falta de homogeneidad en el OT debido a la presencia de bacterias. A partir de imágenes OT de bacterias, su biomasa se obtuvo utilizando un conjunto de imágenes sobre áreas seleccionadas usando el algoritmo de segmentación casero de Matlab (ver subsección “Código numérico”), siguiendo el procedimiento descrito en la ref. 48. En resumen, usamos la relación \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), donde \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) es la imagen de profundidad óptica, \(m\) es el peso seco y \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) es una constante. Elegimos \({{{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg, que es una constante típica de las células vivas.
Se colocó un cubreobjetos de 25 mm de diámetro y 150 µm de espesor recubierto con nanopartículas de oro en una cámara AttofluorTM (Thermofisher) con las nanopartículas de oro hacia arriba. Se precultivó Geobacillus stearothermophilus durante la noche en medio LB (200 rpm, 60 °C) antes de cada día de experimentos. Se colocó una gota de 5 µl de una suspensión de G. stearothermophilus con una densidad óptica (DO) de 0,3 a 0,5 sobre un cubreobjetos con nanopartículas de oro. Luego, se dejó caer sobre la gota un cubreobjetos redondo de 18 mm de diámetro con un orificio de 5 mm de diámetro en el centro y se aplicaron repetidamente 5 µl de suspensión bacteriana con la misma densidad óptica en el centro del orificio. Los pocillos sobre cubreobjetos se prepararon de acuerdo con el procedimiento descrito en la ref. 45 (consulte Información complementaria para obtener más información). Luego agregue 1 ml de medio LB al cubreobjetos para evitar que la capa líquida se seque. El último cubreobjetos se coloca sobre la tapa cerrada de la cámara Attofluor™ para evitar la evaporación del medio durante la incubación. Para los experimentos de germinación utilizamos esporas que, después de experimentos convencionales, a veces cubrían el cubreobjetos superior. Se utilizó un método similar para obtener Sulfolobus shibatae. Se llevaron a cabo tres días (200 rpm, 75°C) de cultivo preliminar de Thiobacillus serrata en medio 182 (DSMZ).
Se prepararon muestras de nanopartículas de oro mediante litografía de copolímero de bloques micelares. Este proceso se describe en detalle en el Cap. 60. Brevemente, se sintetizaron micelas que encapsulaban iones de oro mezclando el copolímero con HAuCl4 en tolueno. Luego, los cubreobjetos limpios se sumergieron en la solución y se trataron con irradiación UV en presencia de un agente reductor para obtener semillas de oro. Finalmente, se cultivaron semillas de oro poniendo en contacto un cubreobjetos con una solución acuosa de KAuCl4 y etanolamina durante 16 minutos, lo que resultó en una disposición casi periódica y muy uniforme de nanopartículas de oro no esféricas en el infrarrojo cercano.
Para convertir los interferogramas a imágenes OT, utilizamos un algoritmo casero, como se detalla en el enlace. 33 y está disponible como paquete Matlab en el siguiente repositorio público: https://github.com/baffou/CGMprocess. El paquete puede calcular la intensidad y las imágenes OT basándose en interferogramas grabados (incluidas imágenes de referencia) y distancias del conjunto de cámaras.
Para calcular el patrón de fase aplicado a SLM para obtener un perfil de temperatura determinado, utilizamos un algoritmo casero previamente desarrollado39,42 que está disponible en el siguiente repositorio público: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. La entrada es el campo de temperatura deseado, que se puede configurar digitalmente o mediante una imagen bmp monocromática.
Para segmentar las células y medir su peso seco, utilizamos nuestro algoritmo Matlab publicado en el siguiente repositorio público: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. En cada imagen, el usuario debe hacer clic en la bacteria o mCFU de interés, ajustar la sensibilidad de la varita y confirmar la selección.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Nature Research Report vinculado a este artículo.
Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles a través de los respectivos autores previa solicitud razonable.
El código fuente utilizado en este estudio se detalla en la sección Métodos y las versiones de depuración se pueden descargar desde https://github.com/baffou/ en los siguientes repositorios: SLM_temperatureShaping, CGMprocess y CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Información sobre los termófilos y sus aplicaciones de amplio espectro. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Información sobre los termófilos y sus aplicaciones de amplio espectro.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. y Sharma, AK Descripción general de los termófilos y su amplia aplicación. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. y Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. y Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. y Sharma AK Un conocimiento profundo de los termófilos y una amplia gama de aplicaciones.3 Biotecnología 6, 81 (2016).
Hora de publicación: 26 de septiembre de 2022